高效液相色譜法測(cè)定追風(fēng)傘提取物中5種酚酸類成分含量

陳 婷，徐加兵

（江蘇省揚(yáng)州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 揚(yáng)州 225000）

追風(fēng)傘為報(bào)春花科植物狹葉落地梅 Lysimachia paridiformis Franch.Var.stenophylla Franch.的 全 草 或根，又名驚風(fēng)傘、公接骨丹、背花草、燈臺(tái)草等，主要分布于我國四川、廣西、貴州，云南等地，味苦、辛，性溫，無毒，有祛風(fēng)通絡(luò)、活血止痛功效，以及抗炎、抗風(fēng)濕[1－3]和抗氧化[4]等藥理作用，常用于治療風(fēng)濕痹痛、半身不遂、小兒驚風(fēng)、跌打及骨折等[5]，亦常與其他藥材組成復(fù)方制劑（巴布劑、凝膠劑、膠囊等）用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等引起的疼痛[6－8]。追風(fēng)傘的主要成分為黃酮類、甾醇類、脂肪酸類及揮發(fā)油類化合物[9－12]，目前，我國學(xué)者主要對(duì)追風(fēng)傘的黃酮類化合物提取工藝進(jìn)行研究[13－14]。本研究中以追風(fēng)傘提取物中綠原酸、蘆丁、異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷、木犀草素、刺槐素為測(cè)定指標(biāo)，采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定追風(fēng)傘提取物中上述5種活性成分的含量，為追風(fēng)傘有關(guān)的新藥及保健產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20A型液相系統(tǒng)（日本島津株式會(huì)社）；N2000型雙通道色譜站（浙江大學(xué)智能信息工程研究所）；RE5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅東玻璃制品有限公司）；TopPette型微量移液器（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器＜北京＞有限公司）；KH3200型超聲清洗機(jī)（寧波恒大超聲設(shè)備有限公司）；MS205型電子天平（梅特勒－托利多國際有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110753－201716），蘆丁對(duì)照品（批號(hào)為100416－201607），木犀草素對(duì)照品（批號(hào)為111520－201605），均購自中國食品藥品檢定研究院；異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)照品（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號(hào)為 P201703）；刺槐素（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號(hào)為P201606）；追風(fēng)傘藥材（亳州吉貝爾現(xiàn)代中藥飲片科技有限公司贈(zèng)送，廣西產(chǎn)，由本中心房克慧主任鑒定為報(bào)春花科植物狹葉落地梅Lysimachia paridiformis Franch.Var.stenophylla Franch.的全草或根；追風(fēng)傘提取物（自制，批號(hào)分別為20170816，20170824，20170905）；甲醇（色譜純，美國天地有限公司）；純化水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A） － 0.2% 醋酸水溶液（B），梯度洗脫(0～17 min時(shí)10%A→42%A，17～25 min時(shí)42%A→60%A，25～40 min時(shí) 60%A→90%A)；流速：1 mL ／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長：334 nm。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：精密稱取綠原酸、蘆丁、異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷、木犀草素和刺槐素對(duì)照品適量，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度分別為 330.6，515.2，318.4，348.2，287.4 mg ／L 的對(duì)照品貯備液。

供試品溶液：稱取經(jīng)干燥并粉碎過40目的追風(fēng)傘藥材適量，加12倍量純化水回流提取1次，收集提取液，再將藥材殘?jiān)?倍量純化水回流提取2次，收集提取液，過150目篩，合并上述3次提取液，加95%乙醇醇沉至含醇量為50%，12 h后離心去沉淀，收集上清液，減壓濃縮。濃縮液上樣HPD400大孔吸附樹脂，依次用2倍柱體積純化水和2倍柱體積20%乙醇洗脫，以除去無機(jī)鹽、水溶性及部分醇溶性雜質(zhì)，再用70%乙醇洗脫4倍柱體積，收集洗脫液，濃縮并真空干燥，干燥提取物粉碎并置密封袋中保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)稱取追風(fēng)傘提取物約100 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用70%乙醇超聲溶解并定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：精密量取2.2項(xiàng)下兩種溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，得HPLC色譜圖，詳見圖1?？梢姡谠撋V條件下，5種成分的分離度均良好。

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液適量，制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積（A）對(duì)對(duì)照品質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，詳見表1。

精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別記錄峰面積。結(jié)果見表2，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取追風(fēng)傘提取物（批號(hào)為20170816）6份，每份約100 mg，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果見表2，表明方法重復(fù)性良好。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果(n＝6)

表2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別于 0，1，3，6，9，12，18，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果見表2，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的追風(fēng)傘提取物（批號(hào)為20170816）6份，每份約50 mg，精密稱定，加入3 mL綠原酸、蘆丁、異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷、木犀草素和刺槐素 質(zhì)量濃度分別為 41.325，64.400，39.800，43.525，35.925 mg ／L 的混合對(duì)照品溶液，置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后進(jìn)樣，計(jì)算峰面積。結(jié)果見表3。

2.4 樣品含量測(cè)定

精密稱取3批次追風(fēng)傘提取物，每批約100 mg，制備3份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，分別計(jì)算含量。結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

檢測(cè)波長[15－17]：通常根據(jù)各個(gè)待測(cè)成分的紫外吸收情況，綜合選擇一個(gè)各成分均具有較好吸收的波長作為檢測(cè)波長。紫外全波長掃描結(jié)果顯示，最大吸收波長綠原酸為253 nm和326 nm，蘆丁為258 nm和361 nm，異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷為255nm和353 nm，木犀草素為255 nm和350 nm，刺槐素為334 nm。綜合考慮，選擇334 nm作為檢測(cè)波長。

流動(dòng)相：乙腈－水和甲醇－水為常用流動(dòng)相體系，一般添加酸提高分離度和改善峰形[18－20]。本研究中嘗試采用乙腈－水、甲醇－水等度系統(tǒng)不同比例流動(dòng)相分別對(duì)綠原酸、蘆丁、異鼠李素－3－O－β－D－葡萄糖苷、木犀草素和刺槐素5種成分進(jìn)行分離，結(jié)果2種等度系統(tǒng)均不能使各成分很好地分離，且保留時(shí)間亦相對(duì)較長，故在此基礎(chǔ)上采用乙腈－水、甲醇－水梯度洗脫對(duì)各成分進(jìn)行洗脫分離，結(jié)果甲醇－水梯度洗脫對(duì)各成分的分離度要優(yōu)于乙腈－水梯度洗脫，且加入0.2%醋酸調(diào)整峰形。

柱溫：嘗試采用不同柱溫（25，30，35℃）考察對(duì)各成分分離度的影響，結(jié)果顯示，在30℃時(shí)色譜基線較平穩(wěn)，且分離度較25℃和35℃好，故最終選擇柱溫為30℃。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

表4 追風(fēng)傘提取物中5種活性成分含量(n＝3)

3.2 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的HPLC法可同時(shí)測(cè)定追風(fēng)傘提取物中綠原酸、蘆丁、異鼠李素 －3－O－β－D－葡萄糖苷、木犀草素和刺槐素的含量，且快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用來評(píng)價(jià)和控制追風(fēng)傘提取物的質(zhì)量，并為追風(fēng)傘相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。