板藍(lán)根特征圖譜及3種成分含量測(cè)定研究

殷世寧，張春輝 ，王海英

（1.山東省青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266071； 2.山東省青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266061）

板藍(lán)根為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán) Isatis indigotica Fort.的干燥根，性寒，味苦，歸心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、涼血利咽之功效，用于治療瘟毒發(fā)斑、舌絳紫暗、痄腮、喉痹、大頭瘟疫、爛喉丹痧、丹毒、癰腫等[1]，主要分布于我國(guó)江蘇、浙江、福建、河南等地。板藍(lán)根在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》上品欄中已有“藍(lán)實(shí)”記載?，F(xiàn)今，板藍(lán)根制劑用量之大，堪稱(chēng)中藥之最，已報(bào)道的板藍(lán)根化學(xué)成分有吲哚類(lèi)、喹唑酮類(lèi)、喹啉類(lèi)、芥子苷類(lèi)、含硫類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、氨基酸類(lèi)和甾醇類(lèi)[2]，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中國(guó)藥典（一部）》，但僅對(duì)板藍(lán)根的性狀、顯微特征、水分、灰分、浸出物、（R，S）－告依春含量測(cè)定等進(jìn)行了控制，質(zhì)控方法較單一。為了更全面地控制板藍(lán)根的質(zhì)量，本研究中參考了2015年版《中國(guó)藥典（四部）》[3]及文獻(xiàn)[4 － 9]，采用高效液相色譜（HPLC）法建立了板藍(lán)根的特征圖譜，并對(duì)15個(gè)特征峰進(jìn)行標(biāo)定，同時(shí)對(duì)板藍(lán)根中尿苷、腺苷、（R，S）－告依春的含量進(jìn)行測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC－20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；BP211D型電子天平（精度 0.01 mg，德國(guó) Sartorius公司）；AUTO Science AS10200BT型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

尿苷對(duì)照品（批號(hào)為887－200202，含量為100%），腺苷對(duì)照品（批號(hào)為110879－200202，含量為100%），（R，S）－告依春對(duì)照品（批號(hào)為 111753－201505，含量為100%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；18批板藍(lán)根（S1～S18）產(chǎn)地信息見(jiàn)表1；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

表1 18批供試品相對(duì)保留時(shí)間測(cè)定結(jié)果

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentEclipsePlusC18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 － 0.05% 磷酸溶液，梯度洗脫（0～10 min時(shí)0.05%磷酸溶液 98%→80%，10～30 min時(shí)0.05%磷酸溶液80%→40%，30～35 min時(shí)0.05%磷酸溶液 40%→ 20%，35～40 min時(shí) 0.05%磷酸溶液：20%→ 40%，40～45 min時(shí) 0.05%磷酸溶液40%→ 98%，45～50 min時(shí) 0.05%磷酸溶液 98%）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按（R，S） －告依春峰計(jì)應(yīng)不低于10 000。

2.2 溶液制備

精密稱(chēng)取尿苷對(duì)照品18.57mg、腺苷對(duì)照品17.28mg、（R，S）－告依春對(duì)照品 20.27 mg，分別置 50 mL 容量瓶中，加水定容至50 mL，制成對(duì)照品貯備液。分別精密量取尿苷、腺苷對(duì)照品貯備液各1 mL，（R，S）－告依春對(duì)照品貯備液5 mL，置25 mL容量瓶中，加水定容至25 mL，制 成 每 1 mL 含 尿 苷 14.856 μg、腺 苷 13.824 μg、（R，S）－告依春 81.080 μg的混合溶液，即得混合對(duì)照品溶液。取板藍(lán)根樣品粉末（過(guò) 4號(hào)篩）0.2 g，精密稱(chēng)定，精密加水10 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 特征圖譜測(cè)定

共有特征峰標(biāo)定：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定50 min，記錄42 min色譜圖，并以國(guó)家藥典委員會(huì)2012.130723版中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算，生成板藍(lán)根的特征圖譜，從中選定共有特征峰15個(gè)。通過(guò)比較混合對(duì)照品溶液及供試品溶液，并結(jié)合DAD光譜，得出供試品溶液圖譜中15個(gè)共有特征峰，其中3號(hào)峰為尿苷，4號(hào)峰為腺苷，6號(hào)峰為（R，S）－告依春。詳見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：按2.1項(xiàng)下色譜條件，精密吸取同一供試品溶液（S1）10 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6次，測(cè)定共有特征峰15個(gè)，以（R，S）－告依春峰作為參照峰（S峰），計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果的 RSD＜1.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（S1），按 2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定共有特征峰15個(gè)，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果的 RSD＜1.5%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（S1），按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于 0，1，8，12，24，36 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定共有特征峰15個(gè)，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果的 RSD＜1.5%（n＝6），表明供試品溶液在 36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

相對(duì)保留時(shí)間確定：采用上述色譜方法分析6批次板藍(lán)根樣品（S6，S7，S9，S10，S15，S16），以（R，S） － 告依春峰作為參照峰（S峰），各共有特征峰相對(duì)保留時(shí)間平均值分別為 0.304，0.332，0.604，0.683，0.799，1.000，1.120， 1.228，1.335，1.383，1.595，1.897，2.025，2.754，2.884，RSD 分別為 0.3% ，0.4% ，0.3% ，0.3% ，0.3% ，0，0.2% ，0.2% ，0.2% ，0.1% ，0.6% ，0.1% ，0.8% ，0.1% ，0.1% （n ＝ 6），允許范圍按 ± 5% 計(jì)算，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間均在規(guī)定范圍內(nèi)。

特征圖譜測(cè)定結(jié)果：對(duì)18個(gè)樣品進(jìn)行特征圖譜分析，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，18個(gè)樣品的15個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間均無(wú)明顯偏差，符合規(guī)定限度。

2.4 指標(biāo)性成分含量測(cè)定

2.4.1 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1，3，5，10，15，20 μL，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。尿苷、腺苷、（R，S）－告依春的回歸方程分別 為 Y＝2.57×106X－5.00×101（r＝0.999 9）， Y＝3.14 ×106X＋9.26×102（r＝1.000 0）， Y＝2.91×105X＋6.64 × 102（r＝0.999 9），線性 范 圍 分別 為 0.014 9 ～0.2971 μg，0.013 8 ～ 0.276 9 μg，0.081 1 ～ 1.621 6 μg，上述各成分進(jìn)樣量在相應(yīng)線性范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：按2.1項(xiàng)下色譜條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果尿苷、腺苷、（R，S）－告依春峰面積積分值的 RSD分別為 0.08%，0.05%，0.03%（n ＝ 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（S1），按2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果尿苷，腺苷，（R，S）－告依春峰面積積分值的RSD 分別為 0.01% ，0.02% ，0.13% （n ＝ 6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（S1），按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于 0，1，8，12，24，36 h 時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果尿苷、腺苷、（R，S）－告依春的峰面積積分值的 RSD均為0.01%(n＝6)，表明供試品溶液在36 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批樣品（S1）粉末（過(guò)4號(hào)篩）0.1 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入尿苷、腺苷、（R，S）－告依春對(duì)照品溶液 3，2，5 mL[對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度尿苷為 14.856 μg ／mL，腺苷為 13.824 μg ／mL，（R，S） － 告依春為 81.080 μg／mL]，按 2.2 項(xiàng)下方法制成供試品溶液，精密吸取 10 μL，按 2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.2 樣品含量測(cè)定

取18批板藍(lán)根樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

本研究中參考文獻(xiàn)[1，4－6]，比較了加水煎煮、加水回流提取、加水超聲提取的方法，發(fā)現(xiàn)采用加水超聲提取的特征圖譜效果最佳，色譜峰數(shù)量較多，且峰高優(yōu)勢(shì)較明顯。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，采用加水超聲提取的方法對(duì)（R，S）－告依春的提取率明顯高于加水煎煮的方法，原因可能為加水煎煮導(dǎo)致板藍(lán)根的淀粉糊化，影響了（R，S）－告依春的提取。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝3）

對(duì)板藍(lán)根中各化學(xué)成分采用等度洗脫方法難以達(dá)到滿(mǎn)意的分離效果，故考慮采用梯度洗脫。本研究中參考文獻(xiàn)[4－9]，分別考察了甲醇－0.1%甲酸溶液、甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.05%磷酸溶液不同比例的流動(dòng)相，并對(duì)梯度比例進(jìn)行了研究，最終選擇文中的流動(dòng)相，分離效果最好，樣品中各特征峰與其他組分峰基本可達(dá)基線分離。

目前，采用多成分含量測(cè)定法控制中藥的質(zhì)量已成為一種檢測(cè)趨勢(shì)[10－11]。本研究中通過(guò)采用所建立的特征圖譜色譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)，對(duì)18批次樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果18批次樣品均檢出15個(gè)特征峰。板藍(lán)根中化學(xué)成分復(fù)雜，本研究中對(duì)板藍(lán)根中尿苷、腺苷、（R，S）－告依春3種成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，指標(biāo)成分（R，S）－告依春為0.034～0.347% ，腺 苷 為 0.001～0.079% ，尿 苷 為0.010～0.051%，可為板藍(lán)根的質(zhì)量控制提供參考。