針刺對短暫性腦缺血發(fā)作大鼠神經(jīng)元凋亡、腺苷水平的影響

張軍 劉敏 唐偉 王威

[摘要]目的 探討針刺對短暫性腦缺血（TIA）發(fā)作大鼠神經(jīng)元凋亡、腺苷水平的影響。方法 Wistar雄性大鼠32只，隨機分為4組，分別為：正常對照組（8只）、假手術組（8只）、模型組（8只）、針刺組（8只）。全腦缺血TIA大鼠模型利用4血管阻斷法建立。針刺組造模后給予電針治療，其余三組不給予任何治療，術后1周后取材。原位末端標記法（TUNEL）染色檢測大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，分光光度計測定大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)腺苷含量。結果 神經(jīng)元凋亡：模型組CA1區(qū)、大腦皮質(zhì)為（36.44±8.96）、（36.94±8.77）個/mm3，高于針刺組的（18.52±6.32）、（20.11±6.70）個/mm2，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。正常對照組（11.54±2.68）、（10.23±3.19）個/mm2、假手術組（13.98±5.47）、（11.63±4.55）個/mm2均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。腺苷含量：模型組CA1區(qū)、大腦皮質(zhì)為（0.139±0.016）、（0.140±0.017）μmol/L mg，低于針刺組（0.176±0.004）、（0.178±0.006）μmol/L mg，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。正常對照組[（0.038±0.006）、（0.039±0.009）μmol/L mg]、假手術組[（0.037±0.006）、（0.038±0.005）μmol/L mg]均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 針刺可以抑制TIA發(fā)作模型大鼠神經(jīng)元凋亡，增加內(nèi)源性腺苷含量。

[關鍵詞]短暫性腦缺血發(fā)作；針灸療法；細胞凋亡；腺苷

[中圖分類號] R246 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）9（c）-0032-03

Effect of acupuncture on neuronal apoptosis and adenosine level in rats with transient ischemic attack

ZHANG Jun1 LIU Min1 TANG Wei1 WANG Wei2▲

1. Department of Neurology， Affiliated Xinhua Hospital of Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116021，China； 2. Department of Rehabilitation， Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116001， China

[Abstract] Objective To study the effect of acupuncture on apoptosis and adenosine level of neurons in rats with transient ischemic attack（TIA）. Methods 32 male Wistar rats are randomly divided into 4 groups， normal control group （8 rats）， sham-operation group （8 rats）， model group （8 rats）， acupuncture group （8 rats）. Global cerebral ischemia TIA rat model was established by four-vessel occlusion. The acupuncture group was adminstered with electro acupuncture therapy and other 3 groups without any other treatment， to sample 1 week after surgery. By the TUNEL dyeing test （In situ terminal labeling） to detect the Neuron apoptosis in cerebral cortex and hippocampus CA1 area， and determine Adenosine content in cerebral cortex and hippocampus area by spectrophotometer. Results The neuronal apoptosis in the CA1 area and cerebral cortex of the model group were （36.44±8.96）， （36.94±8.77） single/mm2 higher than that of the acupuncture group （18.52±6.32）， （20.11±6.70）single/mm2 with significant difference（P<0.05）. As for normal control group and the sham operation group， the values were （13.98±5.47）， （11.63±4.55）single/mm2 both lower than that of model group， with statistical difference （P<0.05）. Adenosine content： the CA1 area and cerebral cortex of the model group were （0.139±0.016） and （0.140±0.017） μmol/L mg， lower than that of the acupuncture group （0.176±0.004） （0.178±0.006） μmol/L mg， with statistical difference （P<0.05）. As for normal control group （0.038±0.006）， （0.039±0.009） μmol/L mg and the sham operation group （0.037±0.006）， （0.038±0.005）μmol/L mg were lower than the model group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Acupuncture can inhibit the apoptosis of neurons in TIA rats and increase the content of endogenous adenosine in them.

[Key words] Transient ischemic attack； Acupuncture therapy； Apoptosis； Adenosine

短暫性腦缺血（TIA）發(fā)作又稱小中風，為急性腦梗死先兆[1]。TIA發(fā)作盡管持續(xù)時間短，但仍具有一定腦損害，研究發(fā)現(xiàn)存在細胞毒性水腫。有研究表明，針刺對TIA發(fā)作有一定療效，但機制不明[2-3]。細胞凋亡（apoptosis）又稱細胞程序性死亡，是TIA發(fā)作腦損傷的一種方式。腺苷是一種遍布人體細胞的內(nèi)源性核苷，有一定的腦保護作用[4]。目前治療TIA發(fā)作，預防缺血腦卒中主要為口服抗血小板藥物，但這些藥物有的患者不能夠耐受，針灸自古以來就用來預防疾病，又稱“針灸治未病”，用來預防中風[5]。本研究利用全腦缺血TIA動物模型，探討針刺對TIA發(fā)作模型大鼠神經(jīng)元凋亡、腺苷水平的影響，為針刺治療TIA發(fā)作，預防進展為腦梗死提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組

雄性SD大鼠購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心（合格證編號為SY（遼）2014101），SPF級，體重（240±30） g，隨機分為4組，每組8只，分別為正常對照組、假手術組、模型組、針刺組，實驗處置提交動物倫理委員會，符合小動物倫理標準。

1.2主要儀器及試劑

一次性無菌針灸針（蘇州順通醫(yī)療器械有限公司，批號：20150820），KWD-808Ⅱ型脈沖電療儀（武進長城醫(yī)療器械有限公司，批號：20140232）；原位末端凋亡檢測試劑盒（北京嘉美紐諾生物科技有限，批號：20140507）。

1.3模型制作方法

參考李軍杰等[6]方法建立TIA大鼠模型。

1.4實驗各組干預方法

正常對照組不給任何干預。假手術組：只進行模型組手術操作步驟，不發(fā)生缺血。模型組：按模型制作方法造模。針刺組：造模后24 h后給予針刺治療。取穴百會，曲池（雙側(cè)），足三里（雙側(cè)）。雙側(cè)“足三里”“曲池”穴連接電療儀，頻率1 Hz，電壓2 V，針刺1次/d，時間30 min，治療7 d斷頭取腦。

1.5實驗取材

一側(cè)大腦置于冰臺上，分離出皮層與海馬，立即放入液氮中凍存，整個過程在0℃條件下進行，時間控制在2 min內(nèi)。另一側(cè)大腦迅速放入-80℃凍存，用切刀前額極向后至枕極平分為5等份，取含有海馬、皮質(zhì)腦片。

1.6 TUNEL法檢測細胞凋亡

將冰凍組織切片置10%中性甲醛中固定，切片上滴加54 μl TdT酶反應液，置濕盒中于37℃反應1 h，滴加過氧化物酶標記的抗體，DAB顯色，復染，用二甲苯脫水，封片、干燥，在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果.顯微鏡組成的圖像處理系統(tǒng)上，測定每組每只大鼠大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)凋亡陽性細胞密度（個/mm2）。

1.7腺苷測定

從液氮中取出大腦皮質(zhì)與海馬組織，稱重，制備成腦組織勻漿，離心吸取上清液用5 mol/L K2CO3溶液中和呈pH 7.4于2 ℃，14 000 r/min離心25 min，吸取上清液，加入1/2體積含3 mmol/L K2HPO4及3 mmol/L EDTA的Tris-HCl 緩沖液，搖勻，分光光度計測定，得到吸光值變化（△E292）的曲線，根據(jù)標準曲線即可測出腦組織腺苷的含量（μmol/L mg）。

1.8統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0軟件包進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用多因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1四組凋亡陽性細胞數(shù)的比較

模型組CA1區(qū)、大腦皮質(zhì)凋亡陽性細胞數(shù)高于針刺組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。正常對照組、假手術組均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2四組腦組織腺苷含量的比較

模型組CA1區(qū)、大腦皮質(zhì)腺苷含量低于針刺組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。正常對照組、假手術組均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2）。

3討論

TIA與中醫(yī)的“小中風”相似。主要病機為氣虛血瘀，肝陽上亢，痰濕阻絡，腦絡瘀阻[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為主要與高血壓病，糖尿病，高脂血癥，肥胖等因素致腦動脈硬化有關。TIA有1/3進展為腦梗死。“針灸治未病”古來有之，是中醫(yī)基礎理論主要的組成部分，早在《內(nèi)經(jīng)》就有強調(diào)預防疾病的觀點[8]。高武在《針灸聚英》中稱此為“逆針灸”[9]。就是在發(fā)病前給予針灸，而預防疾病發(fā)生。中醫(yī)認為針灸可以激發(fā)經(jīng)絡之氣，扶助正氣，祛除邪氣[10]。正氣存內(nèi)，邪不可干，可提高機體抵御各種致病因子的能力，可用于預防中風、感冒、提高機體免疫力等，從而達到防止疾病的發(fā)生、發(fā)展，保健延年的目的[11]。但作用機制尚不明，本研究將進一步深入探討。

本研究選取百會穴位于頭頂正中線與兩耳尖連線的交叉處，穴居巔頂，貫達全身，聯(lián)系腦部，是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴。頭為諸陽之會，百脈之宗，而百會穴則為各經(jīng)脈氣會聚之處。曲池屬于手陽明大腸經(jīng)之合穴，出自《靈樞·本輸》。此腧穴在肘橫紋外側(cè)端，有清熱解表、疏經(jīng)通絡的作用；足三里穴，是“足陽明胃經(jīng)”的主要穴位之一，位于小腿外側(cè)，具有調(diào)理脾胃功效，治下肢痿痹?！鹅`樞》 邪在脾胃，則病肌肉痛，足三里有強壯作用，為保健要穴[12]。這是本研究選取穴位的依據(jù)。

TIA反復多次缺血可誘發(fā)細胞凋亡，是因為缺血誘發(fā)了凋亡相關基因的突變，致局部神經(jīng)元發(fā)生凋亡。本實驗觀察各組大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，模型組可見較多凋亡陽性細胞，提示TIA可誘發(fā)細胞凋亡，而正常對照組、假手術組凋亡陽性細胞少許。針刺組較模型組凋亡陽性細胞明顯減少，提示針刺可抑制神經(jīng)元凋亡，可能是針刺發(fā)揮腦保護作用途徑之一，其機制可能涉及凋亡相關性基因表達[13-14]，有待進一步探討。

腺苷是機體在缺血缺氧時高能磷酸鹽分解產(chǎn)生的一種內(nèi)源性核苷。腦缺血細胞外液腺苷含量增高，為機體保護性反應，有一定腦保護作用[15]。假手術組與正常對照組腦組織腺苷含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），模型組腦組織腺苷含量高于假手術組、正常對照組，提示腦缺血后，可誘發(fā)內(nèi)源性腺苷含量增高，可能為機體的保護機制，針刺組較模型組腺苷含量明顯增高。本實驗結果提示，針刺可使缺血腦組織腺苷含量增高，針刺腦保護機制與腺苷有著極為密切關系，增強內(nèi)源性腺苷含量很可能是針刺腦保護作用機制之一。

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（收稿日期：2018-07-10 本文編輯：崔建中）