胰島素樣生長因子結合蛋白4轉基因小鼠腦內細胞分化的研究

張 賀 勾榮彬 牛含虛 孫曉紅 徐群淵 段德義

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經生物學系 北京腦重大疾病研究院 北京市神經再生修復研究重點實驗室，北京 100069)

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)在腦的正常生長和發(fā)育中起著重要作用，通過Ras-MAPKs(Erk1, 2和p38)和PI-3K/Akt對胚胎腦的神經干細胞和成熟神經元以及成年腦的神經發(fā)生、軸突重塑和新突觸形成發(fā)揮多種效應[1-2]。胰島素樣生長因子結合蛋白(IGF binding proteins, IGFBPs)通過阻礙IGFs與其受體的結合而抑制IGF的生物學作用，但在某些條件下，則可以增強IGF的作用[3]。此外，IGFBP具有IGF非依賴性作用(IGF-independent action)，如IGFBP4通過抑制β-catenin信號通路可以保護缺血損傷的心肌[4]和誘導多能干細胞向心肌細胞發(fā)育[5]。

IGFBPs在腦發(fā)育中發(fā)揮重要作用[2]：如IGFBP1～3, 6導致轉基因動物腦生長減緩或IGFBP5導致相對機體生長較快，IGFBP3導致細胞增生減少，IGFBP1導致神經元、少突膠質細胞和髓鞘形成減少，IGFBP6導致星形膠質細胞減少，但IGFBP4對腦內細胞神經元和神經膠質細胞分化的影響迄今報道不多。本研究室構建了神經元特異性啟動子血小板源性生長因子-β(platelet derived growth factor-β, PDGF-β)驅動的IGFBP4轉基因小鼠，發(fā)現成年小鼠IGFBP4在腦內的分布符合PDGF-β啟動子調控的外源基因在胚胎和成年小鼠中樞神經系統的表達部位，動物體質量未見明顯改變但整腦質量增加了8.4%[6-7]。

本研究進一步明確了IGFBP4轉基因小鼠腦質量增加究竟屬于神經元和(或)神經膠質細胞增多以及IGFBP4激活了胰島素樣生長因子-Ⅰ型受體(insulin-like growth factor-Ⅰ receptor， IGF-IR)信號通路，還是通過IGF非依賴性作用如調控β-catenin而調控腦細胞發(fā)育。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級IGFBP4轉基因C57BL/6J小鼠由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所提供[實驗動物許可證號：SCXK(京)2009-0007]，在首都醫(yī)科大學實驗動物部SPF 級動物房分籠飼養(yǎng)和繁殖。溫度控制在24 ℃左右，相對濕度45% ～ 65%，自動光控，自由進食和飲水。

動物實驗經首都醫(yī)科大學動物實驗及實驗動物福利委員會許可(倫理編號：AEEI-2017-029)，采用簡單隨機化法分別觀察轉基因小鼠(transgenic mouse, TG)和野生型小鼠(wildtype mouse，WT)腦內細胞分化能力、信號通路相關分子表達以及小鼠運動情況。

1.1.2 主要試劑

鼠尾基因組DNA提取試劑盒(CW2094S)和PCR 擴增相關試劑(CW0682M)購自康為世紀生物科技有限公司；PCR引物合成和PCR產物測序由英濰捷基(上海)貿易有限公司完成；實體組織和細胞總蛋白抽提試劑盒(23227)購自普利萊基因技術有限公司；BCA試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；PVDF膜(IPVH00010)購自德國Merck Millipore公司；髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein， MBP)購自美國Proteintech公司(10458-1-AP)；小鼠抗膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體和小鼠抗β-actin抗體購自北京冠星宇科技有限公司；兔抗IGFBP4抗體(NBP1-80549)購自美國Novus Biologicals公司；兔抗NeuN抗體(ab177487)購自美國Abcam公司；兔源性的Erk1, 2、p-Erk1, 2、p38、p-p38、Akt、p-Akt、Bcl-2、Caspase-3和β-catenin等分子抗體均購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG(E030120)和HRP 標記的山羊抗鼠IgG(E030110)購自美國Earthox公司。ECL超敏發(fā)光液購自普利萊基因技術有限公司；X線膠片購自銳珂醫(yī)療公司。

1.2 方法

1.2.1 IGFBP4轉基因小鼠的鑒定

剪取小鼠尾或耳緣組織提取鼠基因組DNA，PCR擴增檢測重組IGFBP4表達框在小鼠基因組的整合。上游引物：5′-GGCCAGATTCATGGACTG-3′(PDGF-β啟動子的第1 190～1 208 bp)，下游引物：5′-AGCTTCTCCTCGGAGCAAG-3′(IGFBP4編碼序列的第86～104 bp)，擴增產物長度472 bp。擴增程序：95 ℃預變性5 min后，進行35個循環(huán)：95 ℃變性60 s，60 ℃退火30 s，和72 ℃延伸60 s，最后72 ℃延伸10 min。1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物后送英濰捷基(上海)貿易有限公司測序。

1.2.2 檢測海馬少突膠質前體細胞

用Isotropic Fractionator細胞計數法[8]分析海馬少突膠質前體細胞比例。生后28 d(postnatal day 28，P28)小鼠用4%(質量分數)多聚甲醛進行灌注固定，取海馬組織勻漿獲得細胞核懸液，加入少突膠質前體細胞核的標志物Olig2抗體孵育，離心加入FITC綠色熒光標記二抗孵育。用流式細胞儀分析至少5 000個DAPI復染的細胞核中Olig2陽性細胞比例。

1.2.3 Western blotting法檢測蛋白的表達

P28轉基因小鼠與野生型小鼠各3只，12月齡轉基因小鼠6只，野生型小鼠5只，提取小鼠嗅球、皮質、海馬、小腦和腦干蛋白，用BCA試劑盒對蛋白質定量分析后每份樣品取10g進行SDS聚丙烯酰胺凝膠[5%(質量分數)的濃縮膠和12%(質量分數)的分離膠]電泳(濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V)，然后轉至 PVDF膜上(膜4.5 cm×8 cm，45 mA，45 min)。10%(質量分數)脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1.5 h后，分別用下列一抗4 ℃孵育過夜：β-actin抗體(1∶2 000)，GFAP抗體(1∶2 000)，IGFBP4抗體(1∶1 000)，NeuN抗體(1∶1 000)，Erk1, 2(1∶1 000)，p-Erk1, 2(1∶1 000)，p38(1∶1 000)，p-p38抗體(1∶1 000)，Akt抗體(1∶1 000)，p-Akt(1∶1 000)，Bcl-2抗體(1∶1 000)，Caspase-3抗體(1∶1 000)，β-catenin抗體(1∶1 000)。HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠抗體(均1∶5 000) 室溫孵育1 h，ECL超敏發(fā)光液孵育3 min，經X線膠片曝光顯影，再用多色熒光、化學發(fā)光凝膠成像系統(FluorChem Q，美國ProteinSimple公司)掃描待測蛋白條帶。用Image J 1.49版軟件分析待測蛋白條帶灰度與作為內參的β-actin或磷酸化蛋白條帶灰度的比值，作為該蛋白的相對表達量。

1.2.4 Rotarod實驗檢測動物行為學

小鼠轉棒實驗(Rotarod test)可以檢測動物運動的協調性和平衡能力[9]。首先在Rotarod(LE8205，Harvard Apparatus)分別訓練2.5月和12月齡動物以適應轉棒運動。第1天上午和下午在恒速模式下(4轉/min和8轉/min)分別訓練小鼠運動5 min，多次練習不能達到這個標準的小鼠淘汰掉。第2天繼續(xù)恒速訓練(16轉/min)小鼠運動5 min(不必淘汰)。第3天進行兩次模擬計時測試，在加速模式下(最大至40轉/min)訓練5 min，測量小鼠從轉棒上掉落時間。第4天正式測試，方法同模擬測試，測量小鼠掉落時間，共3次取平均值，兩次實驗間隔時間大于1 h以避免小鼠過于疲勞。模擬測試與正式測試均需要在安靜避光環(huán)境下進行。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 IGFBP4轉基因小鼠表型的鑒定

獲得C57BL/6J轉基因首建鼠5只，其中1只動物因為外源DNA的插入毛色呈黑褐色，其余為黑色(圖1A)。DNA測序證實PDGF-β啟動子轉錄的mRNA第一個起始密碼子ATG即為IGFBP4蛋白的翻譯起始位點(圖1B)。Western blotting分析表明P28轉基因小鼠(TG)海馬(圖1C)和腦干(圖1D)組織中的IGFBP4表達相對野生型小鼠(WT)有不同程度的增加。

圖1 IGFBP4轉基因小鼠的鑒定Fig.1 Identification of IGFBP4 transgenic mouseA：Transgenic mice are black or black-brown; B：PDGF-β promoter initiated correct transcription and translation of recombinant IGFBP4; C：IGFBP4 expression in P28 mouse hippocampus; D：IGFBP4 expression in P28 mouse brain stem; *P<0.05 vs WT;IGFBP4：insulin-like growth factor binding protein 4；PDGF-β：platelet derived growth factor-β；WT：wildtype mouse；TG：transgenic mouse.

2.2 IGFBP4轉基因小鼠海馬神經元和神經膠質細胞分化

用Isotropic Fractionator并結合流式細胞術(圖2A,2B)分析表明P28轉基因小鼠海馬少突膠質細胞前體細胞(Olig 2+)數量明顯增多(圖2C)。神經元和星形膠質細胞的標志物NeuN(圖2D)和GFAP(圖2E)表達改變不明顯，少突膠質細胞的標志物MBP表達明顯升高(圖2F)。

2.3 IGFBP4轉基因小鼠海馬IGF-IR通路的激活情況

P28小鼠海馬組織IGF-IR通路的激活情況半定量檢測顯示轉基因小鼠海馬Ras-Raf-MAPK通路的p38磷酸化改變不明顯(圖3A)，而Erk1, 2(圖3B)和PI3K-Akt通路的Ak(圖3C)這兩種蛋白的磷酸化明顯升高。

2.4 IGFBP4轉基因小鼠海馬細胞的存活能力

P28轉基因小鼠海馬β-catenin(圖4A)和Bcl-2(圖4B)的表達改變不明顯，而Caspase-3的表達下降(圖4C)。

圖2 轉基因小鼠海馬神經元和膠質細胞的分化Fig.2 Neuronal and glial differentiation in the hippocampus of the transgenic miceA：single parameter histogram of flow cytometric analysis of Olig 2+cells in WT mouse; B：single parameter histogram of flow cytometric analysis of Olig2+cells in TG mice; C：isotropic Fractionator analysis for the number of oligodendrocyte precursors; D：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of NeuN; E：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of GFAP; F：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of MBP; *P<0.05 vs WT; WT：wildtype mouse；TG：transgenic mouse; MBP：myelin basic protein;GFAP:glial fibrillary acidic protein.

圖3 轉基因小鼠海馬MAPK和Akt通路的激活Fig.3 Activation of MAPK and Akt in the hippocampus of the transgenic miceA：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of p-p38; B：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of p-Erk1, 2; C：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of p-Akt; *P<0.05 vs WT；WT：wildtype mouse；TG：transgenic mouse.

圖4 轉基因小鼠海馬細胞的存活Fig.4 Survival of cells in the hippocampus of the transgenic miceA：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of β-catenin; B：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of Bcl-2; C：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of Caspase-3; *P<0.05 vs WT； WT：wildtype mouse；TG：transgenic mouse.

2.5 IGFBP4轉基因小鼠的運動能力

2.5月和12月齡小鼠行為學數據之間相比差異無統計學意義，且與是否轉IGFBP4基因沒有交互作用，而TG和WT小鼠間的數據差異有統計學意義，12月齡動物的運動能力明顯增強(P<0.05)(圖5A)。12月齡轉基因小鼠小腦神經元NeuN(圖5B)以及皮質神經元NeuN(圖5C)和少突膠質細胞MBP(圖5D)的表達均有增加(P<0.05)。

3 討論

利用本研究室自建的神經元過表達IGFBP4轉基因小鼠，發(fā)現幼年動物腦內少突膠質細胞明顯增多，神經元和星形膠質細胞改變不明顯，Erk1, 2和Akt磷酸化升高，Caspase-3表達下調，而β-catenin和Bcl-2表達無明顯改變，12月齡的成年動物小腦和海馬神經元有增多趨勢，其在Rotarod的運動能力也明顯增強。筆者用Isotropic Fractionator結合流式細胞術對腦組織少突膠質前體細胞(Oligo2標記陽性細胞核)進行計數。沒有找到理想的成熟少突膠質細胞核標志物；而MBP標記成熟少突膠質細胞的髓鞘，也不能用免疫組織化學法及體視學作少突膠質細胞計數，因此用Western blotting來半定量分析MBP的表達水平。

圖5 轉基因小鼠轉棒實驗結果和細胞分化情況Fig.5 Rotarod performance of the transgenic mouse and neural differentiationA：improvement of rotarod performance at postnatal months 2.5 and 12; B：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of NeuN in the cerebellum; C：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of NeuN in the cortex; D：Western blotting and statistical analysis for the relative amount of MBP in the cortex; *P<0.05 vs WT；WT：wildtype mouse；TG：transgenic mouse; MBP：myelin basic protein.

IGFs在腦的正常生長和發(fā)育中起著重要作用[1]，在神經干細胞過表達IGF-I，能促進成年轉基因小鼠膠質細胞和神經元的分化[10]，其神經效應主要是通過IGF-IR的Ras-Raf-MAPK和PI3K/Akt通路來實現的[2]。IGFBPs則通過調節(jié)IGFs與其受體的結合而抑制或增強IGF的作用(即IGF依賴性機制)或通過IGF非依賴性機制如調控Wnt/β-catenin經典通路起作用[3]。Wnt經典通路激活促進神經干細胞的增生和分化[11-12]。本研究顯示 IGFBP4轉基因小鼠和野生型小鼠海馬組織的β-catenin蛋白水平沒有發(fā)生明顯改變，說明IGF非依賴性機制(Wnt/β-catenin經典通路)可能沒有參與IGFBP4對少突膠質細胞分化的調控。轉基因小鼠腦Erk1, 2和Akt的磷酸化升高，支持IGFBP4主要是通過IGF-IR通路調控腦內細胞的分化。與轉基因小鼠腦Akt和Erk1,2磷酸化增高不同，本課題組體外實驗顯示：IGFBP4抑制小鼠神經前體細胞增生、降低Akt磷酸化但未明顯改變Erk1,2磷酸化，并促進神經前體細胞向神經元和星形膠質細胞方向的分化[13]，但沒有觀察誘導分化后細胞Akt和Erk1,2的磷酸化。筆者將繼續(xù)觀察神經前體細胞在誘導分化后Akt和Erk1,2磷酸化的改變，這將有助于厘清體內外Akt和Erk1,2不同激活的意義。

Akt激酶的磷酸化則通過上調Bcl-2等抗凋亡分子或降低Caspase-3/9和Bad/Bax等凋亡分子的表達促進神經祖細胞、神經元和少突膠質細胞的存活[2]。Erk1, 2的激活(磷酸化)參與了少突膠質細胞的分化和成熟[2]。本課題組構建的轉基因小鼠IGFBP4過表達主要在神經元，據此推測：神經元合成的IGFBP4蛋白分泌至胞外主要影響了神經元軸突的髓鞘細胞少突膠質細胞的分化，通過激活IGF-IR通路的Erk1, 2促進少突膠質細胞形成。但是，Erk1, 2分子激活與轉基因小鼠海馬少突膠質細胞分化是上下游關系還是平行變化，將在體外實驗中通過阻斷這些信號分子再觀察細胞分化改變來判斷。出生28 d小鼠腦神經元改變不明顯，但12月齡小鼠小腦和皮質神經元NeuN的表達以及皮質少突膠質細胞MBP均有增多，這可能與Akt磷酸化升高，Caspase-3表達下調提高神經元存活能力有關。小腦結構缺陷會造成動物在Rotarod的運動能力減弱[9]。因此，12月齡小鼠小腦和皮層神經元NeuN表達增高可能可以解釋小鼠在Rotarod的運動能力明顯增強。

筆者觀察到的IGFBP4在腦內的作用與已報道[2]的其他IGFBP分子的作用不同：IGFBP1, 2, 3, 5, 6過表達的轉基因小鼠腦內少突膠質細胞、星形膠質細胞或神經元數量減少。因此，本研究結果為運用神經干細胞再生治療臨床前和臨床應用研究修復腦損傷提供新思路。