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    多巴胺受體在胰島β細(xì)胞系和原位組織中的差異性表達(dá)

    2018-12-24 02:24:52李廣文朱進(jìn)霞
    關(guān)鍵詞:高血糖素細(xì)胞系胰島

    李 季 李廣文 張 悅 朱進(jìn)霞

    (首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,北京 100069)

    多巴胺(dopamine, DA)是一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì),不僅廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),在許多外周組織器官也能合成DA,如胃腸道、腎臟、胰腺等,并且參與胃腸動(dòng)力、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、胰腺內(nèi)外分泌等功能的調(diào)節(jié)[1-2]。近年來,越來越多的研究[3-4]表明,DA與血糖調(diào)節(jié)以及糖尿病之間存在聯(lián)系。DA通過與其受體結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用,但關(guān)于DA受體在胰腺組織和細(xì)胞系中的表達(dá)分布研究報(bào)道并不一致。

    2005年,Rubi等[5]在大鼠胰島β細(xì)胞系INS-1E細(xì)胞上用免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)有D2受體的表達(dá),并且激動(dòng)D2受體會(huì)抑制胰島素的分泌。而筆者前期研究[6]結(jié)果顯示DA受體D1、D2和D5廣泛分布在大鼠胰腺組織的內(nèi)分泌部,其中D1受體表達(dá)在分泌胰島素的β細(xì)胞上,D5受體表達(dá)在分泌胰高血糖素的α細(xì)胞和分泌胰多肽的PP細(xì)胞上,D2受體表達(dá)在分泌生長抑素的δ細(xì)胞上。還有研究者[7]應(yīng)用PET/CT顯像技術(shù)觀察到在大鼠胰腺組織中有D2/D3受體表達(dá),但無法明確受體的具體細(xì)胞定位。也有文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道在MIN6細(xì)胞系(小鼠胰島β細(xì)胞系)上表達(dá)D3受體,并且通過影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度抑制胰島素分泌。以上研究結(jié)果表明DA受體在胰腺組織中的分布與細(xì)胞系存在差異,而細(xì)胞系本身又存在腫瘤細(xì)胞的特性,與正常細(xì)胞存在差異[10],也提示DA受體在胰腺組織和胰島β細(xì)胞系中可能存在分布差異,同時(shí)細(xì)胞系的功能與原代也可能存在差異。實(shí)驗(yàn)通過研究大鼠胰腺組織和胰島β細(xì)胞系INS-1(大鼠源)和HIT-T15(倉鼠源)細(xì)胞中DA受體的分布以及INS-1細(xì)胞的內(nèi)分泌功能,為探究DA調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能以及研究結(jié)果不一致的可能原因提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(體質(zhì)量為200~220 g),購于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[動(dòng)物許可證號為:SCXK(京) 2012-0001],國家級動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境,動(dòng)物飼養(yǎng)及操作均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利準(zhǔn)則,給予正常晝夜更替光照,24 h自由食水供應(yīng)。

    1.2 組織制備與冰凍切片

    SD大鼠急性頸椎脫臼處死,沿腹白線切口,進(jìn)入腹腔,迅速取出胰腺組織標(biāo)本,將脂肪等其他組織去除,置于預(yù)冷的中性4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)溶液中固定。24 h后,取出胰腺組織,入15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蔗糖溶液脫水,16~18 h后再取出組織,入30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蔗糖溶液再次進(jìn)行脫水處理,待組織沉于試管底部,取出組織,去除多余液體后置于充滿optimal cutting temperature compound(OCT包埋劑)的包埋盒中并經(jīng)過液氮固化制備成冰凍組織塊-80℃冰箱保存。用Leica冰凍切片機(jī)制備5μm厚度的大鼠胰腺組織冰凍切片,組織平整地貼于經(jīng)過多聚賴氨酸處理后的載玻片上,室溫晾干后于-20℃冰箱儲(chǔ)存。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

    大鼠胰島β細(xì)胞系(INS-1細(xì)胞)培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,含有10%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活的胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS),100 U/ mL青霉素和100 μg/ mL鏈霉素,2 mmol/L L-谷氨酰胺,10 mmol/L HEPES,1 mmol/L丙酮酸鈉,4 500 mg/L葡萄糖和 1 500 mg/L碳酸氫鈉。倉鼠胰島β細(xì)胞系(HIT-T15細(xì)胞)則置于F-12K完全培養(yǎng)基中,含有10%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活的胎牛血清,100 U/ mL青霉素和100 μg/ mL鏈霉素,2 mmol/L L-谷氨酰胺和1 500 mg/L碳酸氫鈉(均來自美國Gibco公司)。在37 ℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),之后每2~3 d更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)皿中細(xì)胞密度融合為70%~80%左右時(shí),需進(jìn)行傳代。細(xì)胞以2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于24孔板中進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色,以5.0×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中進(jìn)行胰島素分泌實(shí)驗(yàn)。以上細(xì)胞購自美國American Type Culture Collection(ATCC)公司。

    1.4 胰腺組織冰凍切片免疫熒光染色

    將制備好的組織切片從-20℃取出,在室溫晾干,抗原修復(fù)后冷卻至室溫。將切片置于染缸中,磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline-Tween-20,PBST)洗片5 min,共3次,用5%(體積分?jǐn)?shù))驢血清封閉非特異性抗原30 min,將封閉血清棄去,再滴加Ⅰ抗(用PBST稀釋),濕盒4℃過夜。隔天取出切片,棄去Ⅰ抗,PBST洗5 min,共3次,滴加熒光Ⅱ抗(用PBST稀釋),室溫孵育2 h,棄去Ⅱ抗,滴加DAPI染細(xì)胞核,室溫孵育5 min,PBST洗5 min,共3次,50%(體積分?jǐn)?shù))甘油封片,熒光顯微鏡下成像。在滴加熒光Ⅱ抗及之后的步驟注意避光。抗體信息詳見表1、2。

    1.5 細(xì)胞免疫熒光染色

    選取培養(yǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞(INS-1、HIT-T15細(xì)胞),棄去培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗2次,每次2 min,之后消化細(xì)胞(步驟同前),取24孔板,每孔加入經(jīng)過高壓滅菌的無菌蓋玻片1張,將細(xì)胞接種于24孔板中的蓋玻片上,每孔加1 mL完全培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱[37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2]中過夜培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取出24孔板,棄去培養(yǎng)液,PBS洗2次,每次2 min,加入中性4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA固定15 min后,PBST洗 5 min,共3次,之后染色步驟同冰凍切片染色。封片時(shí),將蓋玻片有接種細(xì)胞的那面用50%(體積分?jǐn)?shù))甘油貼于載玻片上,熒光顯微鏡下成像??贵w信息見表1,2。

    1.6 INS-1細(xì)胞胰島素分泌實(shí)驗(yàn)

    INS-1細(xì)胞接種至6孔板中,待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。過夜培養(yǎng),每孔培養(yǎng)基更換為 1 mL 的無糖Krebs-Ringer bicarbonate HEPES(KRBH)溶液,在培養(yǎng)箱中[37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2]穩(wěn)定30 min后,換為1 mL含有 2 mmol/L 葡萄糖的 KRBH 液中繼續(xù)再孵育培養(yǎng)1 h,每孔取300 μL液體用于胰島素和胰高血糖素的測定,棄去剩余的KRBH液,之后每孔給予1 mL含有20 mmol/L葡萄糖的KRBH 溶液,孵育1 h后每孔再次留取孵育液體用于胰島素和胰高血糖素的測定。實(shí)驗(yàn)采用放射免疫方法測定孵育液中胰島素和胰高血糖素的濃度(北方生物技術(shù)有限公司)。

    表1 實(shí)驗(yàn)所用Ⅰ抗信息Tab.1 Information of primary antibody

    表2 實(shí)驗(yàn)所用Ⅱ抗信息Tab.2 Information of secondary antibody

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 多巴胺受體在大鼠胰腺組織的分布

    為了探究DA受體在大鼠胰腺組織中的分布,我們運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)的實(shí)驗(yàn)方法,利用4種胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)志物的抗體,即胰島素(insulin, INS)標(biāo)記β細(xì)胞,胰高血糖素(glucagon, GLU)標(biāo)記α細(xì)胞,生長抑素(somatostatin, SST)標(biāo)記δ細(xì)胞和胰多肽(pancreatic polypeptide,PP)標(biāo)記PP細(xì)胞,與不同亞型的DA受體進(jìn)行免疫熒光染色,并運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡成像。如圖1所示:在大鼠胰腺組織中,DA受體D1、D2和D5分布于胰腺組織的內(nèi)分泌部的不同細(xì)胞上,其中D1受體表達(dá)在β細(xì)胞上,D2受體表達(dá)δ細(xì)胞上,D5受體表達(dá)在的α細(xì)胞和PP細(xì)胞上。

    2.2 多巴胺受體在胰島β細(xì)胞系INS-1和HIT-T15細(xì)胞上的分布

    在INS-1細(xì)胞中,D1、D2和D5受體均有表達(dá),并且細(xì)胞均表達(dá)INS免疫陽性,與受體表達(dá)存在共定位(圖2A)。

    在HIT-T15細(xì)胞中也觀察到3種受體D1、D2和D5的表達(dá)(圖2B)。以上結(jié)果表明,DA受體在胰島β細(xì)胞系中的分布不同于原位的胰島β細(xì)胞。

    2.3 INS-1細(xì)胞的內(nèi)分泌功能不同于原位β細(xì)胞

    實(shí)驗(yàn)顯示這兩種胰島β細(xì)胞系的同一個(gè)細(xì)胞不僅表現(xiàn)INS免疫陽性,同時(shí)也表現(xiàn)GLU免疫陽性(圖3A和B)。而在大鼠胰腺組織中,INS和GLU免疫陽性則分別表達(dá)在不同的細(xì)胞上(圖3C)。進(jìn)一步用放射免疫法測定了 INS-1細(xì)胞孵育液(KRBH 緩沖液)中是否含有胰高血糖素。在沒有接種INS-1細(xì)胞的培養(yǎng)孔中,檢測不到胰島素和胰高血糖素,接種INS-1細(xì)胞后,既可檢測到胰島素,也可檢測到胰高血糖素,胰島素濃度會(huì)在20 mmol/L高糖刺激下明顯升高(t=4.708,P=0.000 8,n=6),而胰高血糖素的濃度則沒有明顯變化(t=0.3451,P=0.7418,n=4),詳見表3。

    圖1 多巴胺受體在大鼠胰腺組織的分布Fig.1 Distribution of dopamine receptors in rat pancreatic islets

    Red fluorescence for dopamine receptors, and green fluorescence for INS-, SST-,GLU- and PP-immunoreactivity.Scalebars:100 μm;INS:insulin;SST:somatostatin;GLU:glucagon;PP:pancreatic polypeptide.

    圖2 多巴胺受體在INS-1和HIT-T15細(xì)胞上的表達(dá)Fig.2 Distribution of dopamine receptors in INS-1 and HIT-T15 cells

    Green fluorescence for dopamine receptors, and red fluorescence for INS-immunoreactivity.A:INS-1 cell;B: HIT-T15 cell;Scalebars:25, 10 μm.INS-1:insulin-1.

    圖3 INS和GLU在INS-1、HIT-T15細(xì)胞和大鼠胰腺組織上的表達(dá)Fig.3 Distribution of INS- and GLU-immunoreactivity in INS-1、HIT-T15 cells and rat pancreatic tissue

    Green fluorescence staining for INS-immunoreactivity, and red fluorescence staining for GLU-immunoreactivity.A:INS-1 cell;B: HIT-T15 cell;C: Rat pancreatic tissue;Scalebars:100, 25, 10μm;INS-1:insulin-1.

    表3 INS-1細(xì)胞孵育液中胰島素和胰高血糖素濃度Tab.3 Insulin and glucagon content in INS-1 cell supernatant

    3 討論

    DA及其受體參與胰腺功能調(diào)節(jié)的作用被廣泛研究,盡管其對內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)作用存在許多爭議,但是大量研究[11]都表明DA對胰腺內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)存在關(guān)鍵性作用。本研究基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道,進(jìn)一步探究了DA受體在原位胰腺組織和胰島β細(xì)胞系中的分布以及INS-1細(xì)胞的內(nèi)分泌功能。

    1977年,Hansen等[12]首次在新鮮分離的小鼠胰島的勻漿液中檢測到DA。Mahony和Feldman等[13]進(jìn)一步在金黃地鼠的胰島研究了單胺類遞質(zhì)在胰島中攝取和作用,但他們也強(qiáng)調(diào),對來自不同物種的胰島進(jìn)行實(shí)驗(yàn),其結(jié)果存在巨大差異。同樣,關(guān)于DA受體在不同物種的胰腺組織和細(xì)胞系中的表達(dá)分布的研究報(bào)道也存在差異性。在原位組織中的結(jié)果表明,不同DA受體的亞型分布在大鼠胰腺組織的內(nèi)分泌部中不同的內(nèi)分泌細(xì)胞上[6]。而在不同的胰島β細(xì)胞系的研究中,其研究結(jié)果也存在差異性。在大鼠胰島β細(xì)胞系INS-1E細(xì)胞上用免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)有D2受體表達(dá)在該細(xì)胞上[5],在MIN6細(xì)胞系上表達(dá)D3受體[8]。此外,與DA合成和代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平在小鼠原代分離的胰島和MIN6細(xì)胞中也不一致[9]。筆者在胰島β細(xì)胞系INS-1和HIT-T15觀察了DA受體的分布,發(fā)現(xiàn)該兩種細(xì)胞系均同時(shí)表達(dá)D1、D2和D5受體,與組織中的分布不一致,文獻(xiàn)[14]報(bào)道,腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)本身就與原代細(xì)胞存在差異,培養(yǎng)的細(xì)胞系中的細(xì)胞處于不盡相同的細(xì)胞時(shí)期,因此可能也具有不同的表現(xiàn)[15]。

    此外,腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境也同正常的細(xì)胞存在差異,也可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)功能性上的差異[16-18]。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)這兩種胰島β細(xì)胞系同一個(gè)細(xì)胞不僅表達(dá)INS免疫陽性,同時(shí)表達(dá)GLU免疫陽性,而在原位組織中,INS和GLU免疫陽性則表達(dá)在不同的細(xì)胞上。進(jìn)一步在INS-1細(xì)胞孵育液中既可以檢測到胰島素,也可以檢測到胰高血糖素,提示胰島β細(xì)胞系的內(nèi)分泌功能不同于原位β細(xì)胞。

    本研究證明了DA受體在大鼠胰腺組織和胰島β細(xì)胞系中存在差異性分布,胰島β細(xì)胞系內(nèi)分泌功能也不同于原位β細(xì)胞,為研究胰島β細(xì)胞的功能以及DA對胰島素分泌的調(diào)節(jié)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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