MCC950在野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓模型中的治療作用及其機制研究

齊先梅 王 蕾 張瑞恒 柳 婷 劉 杰 楊 汀 王 軍 張知非* 王 辰,4

(1.首都醫(yī)科大學呼吸病學系，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，北京 100069；3.北京中日友好醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，北京 100029；4.中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院，北京 100730)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是指以肺血管阻力進行性增高，進而引起右心衰竭，導致患者死亡的臨床綜合征。近來，炎性反應在PH的發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受關注[1]。炎性小體是位于胞質內的多蛋白復合物，參與促炎因子如白介素-18(interleukin-18，IL-18)和IL-1β的成熟。炎性小體主要有4種，即NLRP1炎性小體、NLRP3炎性小體、IPAF炎性小體和AIM2炎性小體[2]。其中NLRP3炎性小體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)和procaspase-1組成，是迄今為止研究最多的炎性小體，被證實與多發(fā)性硬化癥、痛風和動脈粥樣硬化等炎性反應相關疾病的發(fā)病機制有關[3-4]。柳婷等[5]研究已證實NLRP3炎性小體參與PH的發(fā)生、發(fā)展，提示其具有作為治療PH的潛在手段，但由于一直缺乏特異性阻斷劑，致使靶向NLRP3炎性小體治療PH的研究停滯不前。目前一種新型的選擇性NLRP3炎性小體抑制劑(MCC950)的發(fā)現[6]，使得這一研究成為可能。MCC950 (CRID3, CP-456、773)是一種二芳基磺酰脲類小分子化合物，最初發(fā)現其能阻斷ASC寡聚并抑制NLRP3炎性反應小體激活[7]。最近研究[6]顯示MCC950能選擇性抑制NLRP3炎性小體，而不抑制NLRP1、NLRC4和AIM2炎性小體。但目前在肺動脈高壓中的作用還不清楚，本研究旨在探討MCC950對MCT誘導的大鼠PH模型的治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

野百合堿(monocrotaline，MCT)， MCC950和抗-GAPDH抗體(兔源)均購自美國Sigma公司；抗-NLRP3抗體(兔源)、抗-Caspase-1抗體(羊源)和抗-IL-1β抗體(羊源)均購自美國Santa Cruz公司；IRDyeTM800標記的驢抗兔和驢抗羊二抗均購于美國Rockland公司；NLRP3、ASC、IL-1β和GAPDH引物均購自大連Takara公司。其他常規(guī)試劑均為國產分析純。Odyssey紅外成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司；梯度PCR儀及顯示系統(tǒng)購自北京北方儀濤商貿有限公司；Real-time qPCR系統(tǒng)購自美國Agilent Technologies公司；導管SPR-838購自美國Millar公司。

1.2 實驗動物建模及分組

SPF級雄性SD大鼠27只，體質量250～300 g，首都醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。采用數字表法將大鼠隨機分為3組(每組9只)：Control組、MCT組、MCT+MCC950組。待大鼠適應環(huán)境后開始實驗，MCT組和MCT+MCC950組：實驗第1天單次腹腔注射MCT(60 mg/kg)；Control組：實驗第1天單次腹腔注射與MCT同等劑量的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液作為溶劑對照。MCT+MCC950組在注射MCT后，第16～28天每2 d鼠尾靜脈注射MCC950(3 mg/kg)[6]，共7次。Control組和MCT組給予同等劑量的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液作為溶劑對照。

1.3 右心室壓力及右心肥厚指數測量

實驗第31天，大鼠給予2%(質量分數)戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，暴露右側頸靜脈，采用經頸靜脈右心導管插管的方法檢測右心室收縮壓 (right ventricular systolic pressure，RVSP)。麻醉處死后開胸取心臟，剪去心房及心耳，再沿室間隔將右心室(right ventricular, RV)和左心室(left ventricular, LV)+室間隔(interventricular septum, S)分離，用濾紙吸干血液后分別稱質量，計算右心肥厚指數RV/(LV+S)。

1.4 肺組織病理學觀察和血管厚度的測定

取各組大鼠左肺，0.9%(質量分數)氯化鈉注射液灌注沖洗后4%(質量分數)多聚甲醛固定48 h，脫水，石蠟包埋，行常規(guī)病理學切片，HE染色。光鏡下觀察肺部細小動脈病理改變。通過Image Pro Plus 5.1測量管腔的內徑和外徑，計算肺小動脈血管壁中層厚度占外徑的百分比(media thickness，MT%)。為明確各級血管的重構情況，將100μm以內的血管分為4級(0～25 μm，26～50 μm，51～75 μm和76～100 μm)，分別統(tǒng)計血管壁中層厚度百分比(MT%)。

1.5 NLRP3 mRNA檢測

采用實時定量反轉錄-聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)方法檢測，Trizol(Sigma Aldrich公司, 美國)法提取肺組織中的RNA；然后用Takara反轉錄試劑盒按試劑盒說明反轉錄為cDNA。-20℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板分別加入NLRP3、ASC、IL-1β和GAPDH正反向引物及相關試劑，于real-time qPCR儀中進行擴增。引物由Primer3.0軟件設計，引物資料見表1。PCR反應條件：95℃預變性5 min后，95℃15s、58℃30s、72℃30s，40個循環(huán)。以GAPDH為內參照，計算相對定量(Relative quantification, RQ)值進行比較。

表1 PCR引物Tab.1 Primer used for real-time PCR

1.6 Western blotting法檢測

提取肺組織蛋白后用BAC法檢測濃度，95 ℃變性5 min。取總量相等的蛋白樣品，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)法電泳，轉膜后5%(質量分數)脫脂奶粉非特異性封閉1 h，加入一抗，NLRP3(1∶50)、Caspase-1(1∶100)、IL-1β(1∶50)和GAPDH(1∶2 000)，4 ℃過夜，分別在IRDye 800標記的驢抗兔溶液(1∶10 000)和驢抗兔羊溶液(1∶10 000)中避光孵育1 h，Odyssey掃膜。用Image Pro Plus 5.1軟件計算蛋白表達條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 右心室收縮壓的改變

在腹腔注射MCT后第31天，MCT組大鼠RVSP較對照組相比明顯升高[(50.72±3.65)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)vs(24.29±1.28)mmHg，P=0.000]造模成功；而MCT+MCC950組大鼠RVSP雖然仍高于對照組[(34.19±1.94)mmHgvs(24.29±1.28)mmHg，P=0.000]，但明顯低于MCT組(50.72±3.65，P<0.01)，MCC950能有效降低MCT肺動脈高壓大鼠模型的RVSP(圖1)。

2.2 右心室肥厚指數的改變

與對照組RVHI 0.29(0.02)相比，MCT組大鼠的RVHI為0.61(0.12)，明顯高于對照組(P=0.000)。MCT+MCC950組RVHI較MCT組下降至0.48(0.15)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；MCT+MCC950組與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01,圖2)。

圖1 各組大鼠右心室收縮壓的比較Fig.1 Comparison of RVSP among different groups*** P=0.000 vs control group,## P<0.01 vs MCT，n=9；△1 mmHg=0.133 kPa.MCT：monocrotaline； RVSP：right ventricular systolic pressure.

圖2 各組大鼠右肥厚指數的比較Fig.2 Comparison of RVHI among different groups* P<0.01，** P=0.000 vs control group,# P<0.01 vs MCT (Mann-Whitney U), n=9； MCT：monocrotaline； RVHI：index of right ventricular hypertrophy.

2.3 肺小動脈結構改變

對照組、MCT組及MCT+MCC950組小血管結構改變如圖3。對照組大鼠肺小動脈管壁薄，管腔正常，周圍無炎性反應細胞浸潤；而MCT組大鼠肺小動脈壁增厚明顯，肺血管及其周圍組織可見大量炎性反應細胞浸潤，平滑肌細胞增生明顯，排列紊亂，管腔狹窄；與MCT組相比，MCT+MCC950組肺小動脈重塑情況明顯改善，但與對照組相比仍重構明顯。與對照組相比，MCT組<100 μm各級血管MT%均顯著增加(P=0.000)；而MCT+MCC950組各級血管MT% 均降低，與MCT組相比，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01，圖4)。

圖3 各組大鼠肺組織Fig.3 Sections of the lungs (HE staining,bar=20 μm)A：control group; B：MCT group; C：MCT+MCC950；MCT：monocrotaline.

圖4 各組大鼠MT%比較Fig.4 Comparison of MT% of small pulmonary arteries among different groups

**P<0.01,***P=0.000vscontrol group,n=3;##P<0.01,###P=0.000vsMCT group,n=3；MCT：monocrotaline；MT：media thickness.

2.4 肺組織NLRP3、IL-1β和ASC mRNA表達

與對照組相比，MCT組大鼠肺組織NLRP3、IL-1β和ASC mRNA表達量明顯高于對照組，分別為(2.24±0.23vs1.00±0.04，P<0.05)、(1.66±0.23vs1.±0.02，P<0.05) 和(2.51±0.19vs1.00±0.08，P=0.000)；MCT+MCC950組NLRP3、ASC和IL-1β mRNA表達量均較MCT組降低，分別為(0.4±0.07vs2.24±0.23，P<0.01)、(0.25 ± 0.11vs1.66±0.23，P<0.01)和(0.56±0.32vs2.51±0.19，P<0.01)；MCT+MCC950組與對照組相比NLRP3 和IL-1β mRNA表達量降低(P<0.01)；ASC與對照組相比

差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖5)。

2.5 肺組織NLRP3、IL-1β和Caspase-1蛋白表達

NLRP3的蛋白表達結果與RT-PCR技術檢測結果基本相符。與對照組相比，MCT組大鼠肺組織NLRP3、IL-1β和Caspase-1蛋白表達量明顯增高，分別為(2.47±0.36vs1.00±0.18，P<0.05)、(1.36±0.11vs1.00±0.03，P<0.01)和(1.50±0.12vs1.00±0.02，P<0.05)；MCT+MCC950組NLRP3、IL-1β和Caspase-1蛋白表達量均較MCT組降低，分別為(1.21±0.03vs2.47±0.36，P<0.05)、(0.66±0.28vs1.36±0.11，P<0.05)和(0.90±0.05vs1.50±0.12，P<0.01)；MCT+MCC950組與對照組相比NLRP3升高(1.21±0.03vs1，P<0.01)；Caspase-1和IL-1β與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖6)。

3 討論

本研究旨在探討MCC950對MCT誘導的肺動脈高壓的治療作用。MCT誘導的大鼠肺動脈高壓模型是目前最常用的肺動脈高壓的模型之一，主要的病理改變與臨床動脈性肺動脈高壓相似。MCT是從野百合種子中提取的一種吡咯里西啶類生物堿，本身沒有毒性，在大鼠體內經肝P450酶系統(tǒng)代謝轉化成有毒性的吡咯野百合堿后作用于肺小動脈管壁，導致血管內皮損傷和功能失調，伴有肺血管平滑肌層明顯增生肥厚。本研究結果顯示， MCT能顯著誘導大鼠形成肺動脈高壓，說明造模成功。

炎性反應在肺動脈高壓疾病進展中的作用越來越受到關注。研究[8]表明，動物模型及人肺動脈高壓疾病發(fā)展過程中炎性反應起到非常關鍵作用。損傷和應激時肺血管細胞產生的炎性反應介質募集炎性反應細胞，而炎性反應細胞可能持續(xù)釋放炎性反應因子和生長因子，形成正反饋的惡性循環(huán)，導致肺組織基質重構、膠原沉積和血管細胞的增生和遷移，最終導致肺血管阻力增加和右心衰竭[9]。有研究[5,10]表明低氧及MCT誘導的肺動脈高壓模型中NLRP3、IL-1β表達顯著上調，提示NLRP3炎性小體的活化及下游的炎性反應因子參與了肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展。研究[5,10]結果顯示格列本脲和鞣花酸能緩解PH并抑制NLRP3炎性小體，提示阻斷NLRP3炎性小體通路可能是PH治療的有效途徑。然而，降糖藥格列本脲和抗氧化劑鞣花酸都是NLRP3炎性小體的非特異性阻斷劑，作用機制復雜。

圖5 RT-PCR檢測各組大鼠肺組織中NLRP3、ASC和IL-1β mRNA水平Fig.5 Lung mRNA level of NLRP3, ASC and IL-1β in rats by real-time PCR*P<0.05,***P=0.000 vs control group, n=3;## P<0.01 vs MCT group,n=3；MCT：monocrotaline；NLRP3：nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat PYD-containing protein 3; IL-1β:interleukin-1β; PCR:polymerase chain reaction.

圖6 Western blotting檢測各組大鼠肺組織中NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表達Fig.6 Expression of lung NLRP3, Caspase-1 and IL-1β in rats by Western blotting* P<0.05,**P<0.01 vs control group，n=3;# P<0.05，## P<0.01 vs MCT group，n=3，MCT：monocrotaline；NLRP3：nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat PYD-containing protein 3; IL-1β:interleukin-1β.

MCC950是新發(fā)現的選擇性NLRP3炎性小體抑制劑，研究證實MCC950可通過2條途徑抑制NLRP3的活化，經典途徑中MCC950抑制Caspase-1的活化以及IL-1β的加工；非經典途徑中MCC950阻斷Caspase-11誘導的NLRP3活化。因此該研究指出MCC950可能與NLRP3結合，從而影響其活化，這一過程可能涉及翻譯后修飾。此外MCC950還可以抑制NLPR3誘導的ASC的寡聚化，而這一過程是NLPR3炎性小體活化的關鍵步驟。研究[6]顯示MCC950特異性抑制NLRP3，是因為其能有效抑制NLRP3炎性小體活化，而不影響NLRP1、NLRC4和AIM2炎性小體，以及K+外流和Ca2+內流。因其選擇性阻斷NLRP3炎性小體的特性，與IL-1β生物抑制劑相比存在某些優(yōu)勢，因為MCC950沒有阻斷主要的抗菌炎性小體NLRC4或NLRP1，靶向性阻斷NLRP3炎性小體不會導致體內IL-1β完全被阻斷[6]，有研究[11]顯示MCC950可能不影響LPS誘導的脾細胞中IL-1β和TNF-α的產生，提示抗菌反應可能保持不變，因此與生物制劑IL-1β單克隆抗體如康納單抗相比，MCC950的免疫抑制作用更小，可能降低機會性感染的風險[12]。

本研究通過檢測3組大鼠的血流動力學和形態(tài)學指標，發(fā)現MCC950能顯著緩解MCT誘導RVSP、RVHI以及各級肺血管重構情況，證實了MCC950對PH的治療作用。通過RT-PCR 和Western blotting法檢測各組大鼠肺組織中NLRP3、IL-1β及相關分子基因轉錄與蛋白表達，發(fā)現MCT組與對照組相比各項指標均上調。而使用MCC950后，NLRP3、IL-1β及相關分子mRNA及蛋白表達與MCT組相比表達降低，且MCT+MCC950組 NLRP3和IL-1β的mRNA量比對照組低，提示MCC950在基因轉錄水平負性調節(jié)NLRP3/IL-1β信號通路的表達，具有較強的NLRP3抑制功能。這項研究的結果表明MCC950可以緩解MCT誘導的大鼠肺動脈高壓，證實NLRP3炎性小體參與了PH的發(fā)生發(fā)展。為選擇性NLRP3炎性小體抑制劑MCC950作為一種有前景的治療藥物提供了證據。

綜上所述，本實驗研究結果提示MCC950可能通過抑制NLRP3炎性小體活性緩解雄性MCT大鼠的肺動脈高壓。MCC950能下調MCT誘導的雄性肺動脈高壓大鼠中NLRP3炎性小體的表達水平，未能完全逆轉MCT大鼠的血流動力學指標和形態(tài)學表現，一方面可能因為實驗給予MCC950干預的時間點選擇在MCT 誘導肺動脈高壓的第16天，肺動脈高壓已經形成，完全逆轉疾病的進程非常困難。另一方面，肺動脈高壓病因及發(fā)病機制復雜，NLRP3炎性小體的激活只是參與肺動脈高壓發(fā)病的機制之一。

本研究將NLRP3炎性小體特異性抑制劑MCC950應用于大鼠MCT-PAH模型，證實了特異性抑制NLRP3炎性小體有作為PAH治療途徑的潛在可能，與之前用非特異性NLRP3抑制劑緩解PAH的研究相比，排除了其他復雜機制的干擾。