乙酰丙酸-十二烷基硫酸鈉對結(jié)核分枝桿菌的殺滅作用及其安全性毒理學(xué)評價

呂霞麗 李自慧 潘麗萍 賈紅彥 張宗德 劉 洋

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 耐藥結(jié)核病研究北京市重點實驗室，北京 101149)

結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的病原菌，嚴(yán)重威脅著人類的健康，切斷結(jié)核分枝桿菌傳播途徑是控制結(jié)核病傳播的重要措施之一。目前常用的結(jié)核分枝桿菌消毒劑有含碘類、含氯類、含醛類、過氧化物類等。這些消毒劑對結(jié)核分枝桿菌都有一定的殺滅作用但也均存在不同的不良反應(yīng)。如含碘類消毒劑會導(dǎo)致過敏[1]，甚至?xí)鸺谞钕偌膊2]等嚴(yán)重后果。含氯類消毒劑對人體皮膚黏膜造成損害，如高濃度的84消毒液(次氯酸鈉)可致使皮膚發(fā)白、水腫發(fā)炎、水皰，致使眼部疼痛、流淚、潰瘍等[3]；84消毒液對操作臺面和金屬器械存在腐蝕性[4]。含醛類消毒劑有強刺激性、毒性和腐蝕性，甚至能引起過敏和哮喘[5]。過氧化物類消毒劑易分解、刺激性強，可引起DNA損傷、基因突變、致癌等[6]。因此，迫切需要更為安全有效的消毒劑切斷結(jié)核分枝桿菌的擴散傳播。

乙酰丙酸-十二烷基硫酸鈉(levulinic acid，sodium dodecyl sulfate，LVA-SDS)是一種廣譜的，殺滅作用較強的新型消毒劑[7-8]。LVA主要生產(chǎn)原料是含纖維素的可再生原料(比如高粱[9]等)，因此不僅成本低、產(chǎn)量高，而且無害無污染。經(jīng)過美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認(rèn)證和批準(zhǔn)[10]，LVA可以加入到化妝品、調(diào)味劑、煙草等食品或者日常用品中，具有很好的安全性。SDS也是FDA認(rèn)證的多功能添加劑，是一種活性添加劑，已經(jīng)廣泛用于日常生活中，比如添加到蛋清、果汁、植物油和明膠中等[11]，其安全性也得到了認(rèn)可?？梢奓VA-SDS確實具有安全性好等優(yōu)點，且對大腸桿菌、沙門菌、人類諾瓦克病毒等多種微生物均有較好的殺滅作用，但國內(nèi)對結(jié)核分枝桿菌的殺滅作用的研究報道較少。因此，本研究將LVA和SDS簡單混合后，初步探討對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的殺滅作用，并對其在實際應(yīng)用時的安全性進行評價。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1)菌株：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC_27294)，耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株(同時對利福平、異煙肼耐藥，臨床藥敏編號2202)，均來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院國家結(jié)核病臨床實驗室菌株庫。

2)消毒劑：純度98%，密度1.134 g/mL的乙酰丙酸(Acros Organics公司, 美國)(按體積分?jǐn)?shù)配制所需的不同濃度溶液)，十二烷基硫酸鈉(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)(按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配制所需的不同濃度溶液)，兩者具體配比參考文獻[9]；有效氯含量為1 000 mg/L的次氯酸鈉(北京洗得寶消毒制品有限公司)，商用名“84消毒液”(按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配制)。

3)中和劑：LVA-SDS中和劑[7]為0.1 mol/L PBS溶液，次氯酸鈉中和劑[12-13]為5 g/L硫代硫酸鈉、3 g/L卵磷脂、10 g/L吐溫-80的PBS溶液。

4)有機干擾物：3%(體積分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白(BSA)。

5)試驗動物：SPF級BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～20 g，采用區(qū)組隨機化分組，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號：SYSK(京)2015-0007。該動物實驗經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：2017-6)。

1.2 懸液定量殺菌試驗[13]

1)菌懸液制備：在無菌磨菌瓶中加入1～2滴10%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-80水溶液，用無菌吸管尖端或無菌接種環(huán)刮取2～3周改良羅氏培養(yǎng)基處于對數(shù)生長期的新鮮菌落，置于磨菌瓶中。之后旋緊瓶蓋在渦旋振蕩器上振蕩30～60 s。靜置10 min后，打開瓶蓋，加入約2 mL無菌0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，輕輕晃動后靜置片刻，使菌液中的大塊物質(zhì)沉淀。用無菌吸管吸取中上部的菌液約1 mL，轉(zhuǎn)移至另一無菌試管中，與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?。逐漸滴加無菌0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，直至菌液濁度與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁芤恢?，即得? mg/mL的菌懸液，備用。

2)中和劑鑒定試驗：具體操作詳見2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》[13]規(guī)定的中和劑試驗方法，現(xiàn)簡述如下：設(shè)置平行6組實驗，按照懸液定量殺菌試驗程序進行。①消毒劑+菌懸液；②(消毒劑+菌懸液)+中和劑；③中和劑+菌懸液；④(消毒劑+中和劑)+菌懸液；⑤稀釋液+菌懸液(正常菌陽性對照)；⑥稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基(陰性對照)。其中稀釋液為去離子水；②組和④組區(qū)別在于：④組消毒劑與中和劑先接觸，終止消毒劑的殺滅效能；而②組消毒劑與菌懸液先接觸，之后使用中和劑，主要用于控制消毒劑的殺滅時間。消毒劑與細(xì)菌懸液作用5 min，試驗在常溫下進行。試驗重復(fù)3次(每次3個重復(fù)，共做了3次)均符合2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》的中和劑評定標(biāo)準(zhǔn)時，表明所選中和劑及其濃度適宜。

3)懸液定量殺菌試驗：在無菌試管內(nèi)加入0.5 mL菌懸液和0.5 mL有機干擾物[3%(體積分?jǐn)?shù))BAS]，置于(20±1)℃水浴中備用。加入4 mL倍比稀釋的LVA-SDS消毒劑[陽性對照為0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，陰性對照為1 000 mg/L含氯消毒劑]，立即混勻。作用5、15、30 min后，取0.5 mL混合液加入4.5 mL中和劑，混合中和作用10 min。取0.1 mL混合液置于7H10固體培養(yǎng)基上，用L棒涂抹均勻，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)1個月，觀察結(jié)果并記錄菌落總數(shù)(CFU/mL)，計算平均殺滅對數(shù)值(N)。所有試驗均重復(fù)3次。按照下列公式計算平均殺滅對數(shù)值：平均殺滅對數(shù)值(N)=對照組平均活菌濃度的對數(shù)值(No)-試驗組活菌濃度的對數(shù)值(Nx)。

1.3 消毒劑的安全性毒理學(xué)評價試驗[13]

1)急性經(jīng)口毒性試驗：本實驗選用該方法用于評價消毒劑的急性毒性反應(yīng)。采用一次最大限度試驗法。選用SPF級BALB/c小鼠12只，每組6只，雌雄各半。試驗前小鼠隔夜禁食12 h，不禁水。參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》，采用灌胃方式，按照0.4 mL·20 g-1給予受試液[20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS]，用灌胃針頭將受試液經(jīng)口一次給予動物，連續(xù)觀察14 d，觀察并記錄動物中毒的表現(xiàn)和死亡情況，計算LD50(采用累積法計算LD50)。試驗結(jié)束后，處死存活動物，進行解剖，肉眼觀察是否出現(xiàn)組織和臟器異常。

2)蓄積毒性試驗：本實驗選用該方法用于評價消毒劑的慢性毒性反應(yīng)。選用SPF級BALB/c小鼠12只，每組6只，雌雄各半。試驗前小鼠隔夜禁食12 h，不禁水。采用灌胃方式，每天灌胃一次，按照0.4 mL·20 g-1計算染毒量，每4天為一期。第一期劑量為0.1 LD50，以后每期的劑量按照《消毒技術(shù)規(guī)范》中定期遞增染毒劑量用表中所示遞增，直至半數(shù)動物死亡為止，計算累積總劑量即為LD50(n)。如果給藥28天，死亡動物仍不足半數(shù)，即停止實驗。蓄積系數(shù)(K)公式：K=LD50(n)/LD50，計算并確定蓄積毒性分級。

3)皮膚刺激試驗：本實驗選用該方法用于評價消毒劑對皮膚是否存在刺激性。選用SPF級BALB/c小鼠6只，雌雄各半。試驗前24 h觀察小鼠耳緣皮膚是否完好，無破損，次日將消毒液(20%LVA+2%SDS)直接涂抹于一側(cè)完整的皮膚上，另一側(cè)作為空白對照。分別于1、24、48 h后觀察皮膚的局部反應(yīng)，根據(jù)有無紅斑和水腫形成，進行皮膚反應(yīng)刺激評分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 中和劑鑒定試驗

第1組無菌落生長。第2組有菌落生長，較第1組為多，但較第3、4、5組為少。第3、4、5組，組間菌落數(shù)在1×107～5×107CFU/mL，誤差率不超過15%。第6組無菌落生長，詳見表1。結(jié)果表明，0.1 mol/L PBS溶液可以有效中和濃度20%(體積分?jǐn)?shù))LVA、20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS的消毒劑對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv和耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的殘留作用，且中和劑及其產(chǎn)物對試驗菌生長和培養(yǎng)基無不良影響，符合有效中和劑結(jié)果判定要求。5 g/L硫代硫酸鈉、3 g/L卵磷脂、10 g/L吐溫-80的PBS溶液均可以有效中和濃度為1 000 mg/L的次氯酸鈉，符合有效中和劑結(jié)果判定要求。

2.2 懸液定量殺菌試驗結(jié)果

統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，20%(體積分?jǐn)?shù))LVA和20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS作用30min對菌懸液內(nèi)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的殺滅對數(shù)值(5.03 ±0.17vs5.53 ±0.38)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；20%LVA 及20%LVA+2%SDS和1 000mg/L次氯酸鈉(6.20 ±0.00)的殺滅對數(shù)值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，詳見表2。

表1 含氯消毒劑、LVA和LVA-SDS消毒劑的中和劑鑒定試驗結(jié)果Tab.1 Neutralizer qualification test results for chlorine-containing disinfectants, LVA, and LVA-SDS disinfectants

LVA：levulinic acid；SDS：sodium dodecyl sulfate.

20%(體積分?jǐn)?shù))LVA和20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2% (質(zhì)量指數(shù))SDS作用30min對菌懸液內(nèi)耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的殺滅對數(shù)值(5.03 ±0.15vs5.12± 0.06)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；20%(體積分?jǐn)?shù))LVA 及20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS和1 000mg/L次氯酸鈉殺滅對數(shù)值(6.17 ±0.00)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；詳見表3。含有效氯1 000mg/L的“84消毒液”對結(jié)核分枝桿菌的殺滅作用強于20%(體積分?jǐn)?shù))LVA和20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS。

表2 LVA-SDS在不同濃度、時間條件下對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的殺滅作用Tab.2 Killing effect of LVA-SDS on Mycobacterium tuberculosis standard strain H37Rv at different concentrations and times

表3 LVA-SDS在不同濃度、時間條件下對耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的殺滅作用Tab.3 Killing effect of LVA-SDS on clinical isolates of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis at different concentrations and times

2.3 LVA-SDS的安全性毒理學(xué)試驗結(jié)果

1)急性經(jīng)口毒性試驗：結(jié)果為LD50>5 000 mg/kg，參照《消毒技術(shù)規(guī)范》[13]中的毒性評價可知，該消毒劑屬實際無毒級。試驗期間實驗動物未出現(xiàn)異常，無死亡。實驗結(jié)束后，解剖處死的實驗動物，肉眼觀察未見任何組織或臟器異常。

2)蓄積毒性試驗：試驗連續(xù)進行28 d，小鼠均無死亡，蓄積系數(shù)K>5，參照《消毒技術(shù)規(guī)范》[13]中的蓄積毒性分級可知，該消毒劑為輕度蓄積毒性。

3)皮膚刺激試驗：觀察1、24、48 h后，結(jié)果顯示實驗動物皮膚刺激反應(yīng)無紅斑和水腫形成，皮膚刺激積分均為0，皮膚刺激指數(shù)<0.5，參照《消毒技術(shù)規(guī)范》[13]中的皮膚刺激評價標(biāo)準(zhǔn)可知，對小鼠皮膚無刺激性。

3 討論

結(jié)核病是目前由單一致病菌導(dǎo)致死亡最多的疾病，是全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題之一。我國是全球27個耐多藥肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家之一，2007-2008年全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者中耐多藥率為8.32%。據(jù)此估算，我國每年新發(fā)耐多藥結(jié)核患者12萬例，耐多藥結(jié)核病患者數(shù)位居全球第2位。耐多藥肺結(jié)核患者與普通肺結(jié)核患者相比，傳染期更長，傳染危害更大[14]。消毒劑是切斷結(jié)核分枝桿菌傳播途徑的有效手段之一，對消毒劑的研究應(yīng)引起研究者的重視。

本研究結(jié)果表明，LVA-SDS消毒劑對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株均存在較好的殺滅作用。本實驗所設(shè)定的一系列梯度濃度的消毒劑得到的殺滅試驗結(jié)果顯示，LVA-SDS消毒劑的殺滅作用隨著作用時間和作用濃度的增加不斷增強；20%LVA、20%LVA+2%SDS對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株作用30 min后的平均殺滅對數(shù)值均>5.00，且連續(xù)培養(yǎng)觀察2～3個月后未見新鮮菌落生長。20%(體積分?jǐn)?shù))LVA、20%(體積分?jǐn)?shù))LVA+2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS、1 000 mg/L次氯酸鈉和陽性對照組對結(jié)核分枝桿菌及耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株作用30 min的殺滅作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；相比同濃度的LVA， LVA-SDS聯(lián)合作用的殺滅作用會更趨于穩(wěn)定，效果會更好，此結(jié)果與文獻報道[9,15]一致，即兩者具有協(xié)同殺滅作用。LVA-SDS對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株殺滅作用與消毒劑的濃度和作用時間成正相關(guān)。根據(jù)本研究結(jié)果LVA-SDS有可能用于臨床結(jié)核分枝桿菌的滅菌消毒，如器械消毒、空氣消毒等。結(jié)合本研究獲得的毒理學(xué)結(jié)果，LVA-SDS在未來殺滅結(jié)核分枝桿菌的過程中具有對皮膚無刺激性、對人體無急性和慢性毒性等優(yōu)勢?？梢?，LVA-SDS對結(jié)核分枝桿菌除了有很好的殺滅作用，還具有很好的安全性、無腐蝕性、無害無污染、無刺激性、無不良作用等優(yōu)點[9,15-16]。LVA-SDS混合液在常溫下保存60 d性質(zhì)穩(wěn)定且殺滅活性不變[17]。

1 000 mg/L含氯消毒劑的對照組對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株作用30 min后的平均殺滅對數(shù)值均>5.00，可達(dá)到完全殺滅作用?？梢?，含氯消毒劑確實存在較強的殺滅作用。與含氯消毒劑相比較，LVA-SDS消毒劑雖然在短時間和低濃度時的殺滅作用稍差，但是高濃度和長時間作用后卻有著不錯的殺滅效果。另外LVA-SDS具有無害無污染、安全性好等優(yōu)點，而含氯消毒劑具有刺激性強和腐蝕性等缺點。因此，LVA-SDS用于結(jié)核分枝桿菌的消毒工作具有不錯的應(yīng)用前景。

本研究顯示，LVA-SDS對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株具有較好的殺滅作用，且毒理學(xué)實驗結(jié)果顯示LVA-SDS消毒劑屬實際無毒級，輕度蓄積毒性作用且對皮膚無刺激性，具有較強的實際應(yīng)用價值。筆者在后續(xù)研究中會結(jié)合醫(yī)院感染控制的實際需要，不斷改變LVA-SDS對結(jié)核分枝桿菌殺滅作用的實驗條件和影響因素，進一步提高LVA-SDS消毒劑的應(yīng)用價值。