利用雙電極電壓鉗檢測(cè)rs12899798單核苷酸多態(tài)性對(duì)α7煙堿受體功能的影響

薛奮勤 薛 冰

(首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,北京 100069)

煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic receptor，nAChR)-α7廣泛分布于哺乳動(dòng)物的大腦中，并在腦功能，尤其是學(xué)習(xí)和記憶中起重要作用。1個(gè)典型的nAChR由5個(gè)亞基組成[1]，這5個(gè)亞基可以是相同的(如α7)或不同的(如α4β2)。在哺乳動(dòng)物的大腦中，主要的亞型是α4β2和nAChRs α7[2]。許多其他亞型以不同的α(2～10)和β(2～4)亞基進(jìn)行組合，從而產(chǎn)生功能多樣性的離子通道蛋白。nAChR功能的微小變化，例如單一突變，可能對(duì)腦功能具有顯著影響[3]。

nAChR α7廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和自主神經(jīng)節(jié)。這個(gè)受體比其他亞型的nAChR具有更高的鈣通透性[4]。除了興奮性突觸傳遞之外， nAChR α7還在遞質(zhì)釋放，神經(jīng)突生長，神經(jīng)元存活和凋亡以及神經(jīng)元可塑性中發(fā)揮重要作用[5]。 nAChR α7功能障礙與多種神經(jīng)和精神疾病有關(guān)。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是同一物種個(gè)體之間DNA序列單堿基的變異。SNP的位置可以位于人類基因組的任何地方。在一個(gè)基因內(nèi)，SNP可以位于內(nèi)含子或外顯子中[6]。單核苷酸的錯(cuò)義突變、插入或缺失將改變蛋白質(zhì)序列，并且可能影響蛋白質(zhì)表達(dá)和功能。通過檢索美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的SNP數(shù)據(jù)庫，筆者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)導(dǎo)致α7亞基錯(cuò)義突變的SNP位點(diǎn)W55G，它在受體蛋白上位于配體的結(jié)合區(qū)域。本研究利用雙電極電壓鉗檢測(cè)了W55G點(diǎn)突變對(duì)α7煙堿受體活化及脫敏等功能特性的影響。

1 材料與方法

1.1 突變體的構(gòu)建和cRNA制備

將編碼人nAChR α7亞基的cDNA克隆到pGEMHE卵母細(xì)胞表達(dá)載體中。采用基于PCR的定點(diǎn)突變方法(Stratagene公司，美國)構(gòu)建W55G突變體，并進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。接下來，將nAChR α7野生型和突變體載體通過NheI酶切而進(jìn)行線性化后，使用T7 RNA聚合酶通過體外轉(zhuǎn)錄法而得到各自的cRNA；用DNA酶將DNA模板降解后，將cRNA純化并重懸于焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate， DEPC)水中。最后在1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上查驗(yàn)cRNA產(chǎn)量和完整性,在紫外光光度計(jì)(NanoDrop 2000/2000c， Thermo Fisher公司，美國)上測(cè)其濃度，并將RNA濃度分別調(diào)整至大約1 g/L備用。

1.2 非洲爪蟾卵母細(xì)胞制備和cRNA的注射

先用0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))MS-222麻醉雌性非洲爪蟾，然后將卵巢葉取出并置于孵育緩沖液(82.5 mmol/L NaCl，2.55 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L CaCl2,1 mmol/L Na2HPO4,0.6 mmol/L 茶堿，2.5 mmol/L 丙酮酸鈉，5 mmol/L HEPES，50 mg/L慶大霉素，50 U/mL青霉素和50 mg/L鏈霉素，pH值為7.5。將卵巢葉切成小塊，并在室溫下用膠原蛋白酶消化1.5～2.0 h。選取VI期卵母細(xì)胞，用Nanoject微量注射系統(tǒng)(Drummond公司，美國)將cRNA注射其中(每個(gè)卵母細(xì)胞20～60 nL)，放入16 ℃的生化培養(yǎng)箱中搖蕩培養(yǎng)。

1.3 雙電極電壓鉗記錄

cRNA注射1～3 d后，室溫下(22 ℃)用雙電極電壓鉗記錄電流。電極內(nèi)充灌3 mmol/L 的KCl溶液，使用GeneClamp 500B放大器(Axon Instruments公司，美國)，卵母細(xì)胞被鉗在-60 mV，以50 Hz對(duì)電流信號(hào)進(jìn)行濾波。用Pclamp10.0來分析和處理電流數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 W55在α7亞基上的位置

W55在nAChR α7一級(jí)結(jié)構(gòu)中和三維結(jié)構(gòu)模型的位置見圖1。這個(gè)色氨酸殘基位于nAChR α7亞基的羧基端的loop D，是一個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)，在所有神經(jīng)元nAChR亞基中都是保守的。

圖1 W55在nAChR α7一級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)模型的位置Fig.1 Location of W55 in the receptor：sequence (loop D) and 3D modelLocation of the W55 in 1D (aligning with nAChR β2) and 3D structure of an nAChR α7 subunit；nAChR：α7 nicotinic receptor.

2.2 W55G突變使nAChR α7 對(duì)乙酰膽堿的敏感性降低，但增加了Imax

本研究在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)了W55G突變體，并檢測(cè)了突變體對(duì)受體天然激動(dòng)劑乙酰膽堿(choline,ACh)的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與野生型α7受體相比，需要更高濃度的乙酰膽堿才能刺激突變體受體W55G產(chǎn)生電流(圖2A)。突變體W55G的劑量-效應(yīng)關(guān)系見圖2B。與野生型α7受體相比，其劑量-效應(yīng)曲線右移數(shù)倍。野生型受體中乙酰膽堿的EC50為(210.5±24.3)μmol/L。相比之下，W55G突變體的EC50為(1 375.3±130.5)μmol/L，突變體對(duì)其天然神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性降低6.5倍。

為了進(jìn)一步檢測(cè)突變體對(duì)ACh的反應(yīng)變化，在蛙卵中注射相同劑量的RNA,比較了ACh誘導(dǎo)的最大電流(Imax)。在注射2 d后，突變體受體中的Imax(由3.16 mmol/L Ach刺激誘導(dǎo))顯著高于野生型(約6倍)(圖2C)。

2.3 W55G突變使nAChR α7 對(duì)膽堿的敏感性降低

野生型和突變體W55G對(duì)膽堿的電流反應(yīng)情況見圖3A。與野生型受體相比，W55G的劑量-效應(yīng)曲線明顯右移，突變受體對(duì)膽堿的敏感性也降低了(圖3B)。野生型對(duì)膽堿的EC50為(1 466.7±174.3)μmol/L，而W55G的EC50為(4 610.3±188.5)μmol/L，突變受體對(duì)膽堿的敏感性降低了約3.14倍。

圖2 W55G突變使nAChR α7對(duì)乙酰膽堿的敏感性降低Fig.2 W55G mutation reduced ACh sensitivity but with increased ImaxA：raw traces of ACh-induced currents in the oocytes expressing wild type (WT) and W55G mutant with increasing concentrations; B：averaged dose-response relationship of ACh in the two conditions.W55G mutant exhibited a -6.5 folds decrease of the acetylcholine sensitivity， ***P<0.001 vs wild type nAChR receptor; C：Mutant W55G showed significant increase in maximal current；nAChR：α7 nicotinic receptor； ACh：choline.

圖3 W55G突變使nAChR α7對(duì)膽堿的敏感性降低Fig.3 W55G mutation reduced choline sensitivityA：raw traces of choline-induced currents in the oocytes expressing wild type(WT) and W55G mutant with increasing concentrations; B：averaged dose-response relationship of choline in the two conditions.W55G mutant exhibited a -3.14 folds decrease of the choline sensitivity.***P<0.001 vs nAChR receptor；nAChR：α7 nicotinic receptor.

2.4 W55G突變改變了nAChR的脫敏動(dòng)力學(xué)

本研究比較了nAChRα7野生型和突變體W55G的電流曲線，對(duì)于突變體W55G，盡管使用了較高濃度的乙酰膽堿，但其脫敏動(dòng)力學(xué)仍然較野生型受體顯慢(圖4A)。圖4B中擬合得到了通道脫敏的時(shí)間常數(shù)，結(jié)果表明：野生型nAChR α7的時(shí)間常數(shù)為(173.17±28.08)ms (n=4); W55G突變體的時(shí)間常數(shù)為(785.49±78.20)ms (n=4)。W55G突變體時(shí)間常數(shù)明顯比野生nAChR更高，其脫敏速率變慢。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)nAChR α7中SNP導(dǎo)致的W55G突變顯著降低了對(duì)其天然配體乙酰膽堿和膽堿的敏感性，并且增加了Imax，而且該突變使受體對(duì)于乙酰膽堿的脫敏速率變得較慢。這些功能的改變可能重塑突觸后反應(yīng)，對(duì)于腦疾病的發(fā)生可能會(huì)有較大影響。

nAChR α7具有比其他亞型nAChR更高的鈣通透性[4]。除了興奮性突觸傳遞之外，它還在遞質(zhì)釋放，神經(jīng)突生長，神經(jīng)元存活和凋亡以及神經(jīng)元可塑性中發(fā)揮重要作用[7]。nAChR α7功能障礙與多種神經(jīng)和精神疾病有關(guān)。例如，分析顯示nAChR α7可能與精神分裂癥有關(guān)[8]，nAChR α7蛋白所對(duì)應(yīng)的缺失與癲癇發(fā)作和智力低下有關(guān)[9-10]。盡管沒有關(guān)于nAChR α7與阿爾茨海默病的遺傳關(guān)聯(lián)的報(bào)道，但膽堿能神經(jīng)元的退化伴隨著nAChR的丟失，并且與典型的臨床癥狀相關(guān)[11]，例如學(xué)習(xí)和記憶能力受損，以及認(rèn)知能力逐漸下降。因此，nAChR功能的微小變化，例如單一突變，可能對(duì)認(rèn)知功能沒有顯著影響，可能會(huì)有緩慢的作用，導(dǎo)致神經(jīng)元逐漸喪失，隨著衰老而變得更加明顯。

圖4 W55G突變改變了nAChR α7的脫敏動(dòng)力學(xué)Fig.4 W55G mutation altered desensitization kinetics of nAChR α7A：Typical current traces induced by high concentration of Ach (10 mmol/L) for wild type (WT) nAChR α7 and its mutant W55G; B：Current traces were fitted.***P<0.001 vs wild type nAChR α7；nAChR：α7 nicotinic receptor.

SNP是同一物種個(gè)體之間DNA序列單堿基的變異。 SNP的位置可以位于人類基因組的任何地方。在一個(gè)基因內(nèi)，SNP可以位于內(nèi)含子或外顯子中。內(nèi)含子中的SNP可影響RNA剪接效率或改變RNA剪接模式。外顯子中的SNP可位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)或5′/ 3′非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)中。編碼區(qū)中的SNP可能導(dǎo)致突變，插入或刪除。在nAChR亞基的編碼區(qū)域中，近一半的突變是同義或沉默突變，DNA序列中突變?yōu)橄嗤被釟埢牟煌艽a子。然而，單核苷酸的錯(cuò)義突變，插入或缺失將改變蛋白質(zhì)序列，并且可能影響蛋白質(zhì)表達(dá)或功能。

色氨酸殘基被認(rèn)為是結(jié)合和通道門控中的重要?dú)埢?。它在所有神?jīng)元nAChR亞基中較為保守。然而，在人群中天然存在的W55G突變體沒有普遍認(rèn)可和充分表征。它對(duì)受體通道功能的影響不得而知。本研究在體外表達(dá)并用雙電極電壓鉗檢測(cè)nAChR α7突變體的性質(zhì)，這對(duì)接下來研究該突變體對(duì)疾病的影響有重要的意義。