柴胡疏肝散精簡方對抑郁大鼠中縫核內(nèi)5-羥色胺及色氨酸羥化酶2的影響

高雪松 趙靜潔 王永志 杜 儀 王安娜 張銀鳳 李 麗*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100050;2.北京市隆福醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科北苑院區(qū)，北京 100010; 3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院國際醫(yī)療部，北京 100050)

抑郁癥是嚴重危害人類心身健康的常見精神疾病，以情緒低落、注意力不集中、失眠、健忘等為主要表現(xiàn)[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)[2]的一項報告，全世界約有3.22億人口受抑郁困擾，占全球人口的4.4%。中醫(yī)認為抑郁癥主要由肝氣郁結(jié)所致，治療以疏肝解郁為法，柴胡疏肝散為疏肝解郁的基本方劑，臨床中以此方精簡治療肝郁氣滯型抑郁癥患者，效果顯著。在抑郁癥的諸多發(fā)病機制中，單胺遞質(zhì)假說獲得了Vidal[3]的認同，即單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的缺乏導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)作為重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，其絕對或相對不足是抑郁癥的重要發(fā)病機制[4]。色氨酸羥化酶2(tryptophan hydroxylase 2，TPH2)多存在于腦干中縫核5-HT神經(jīng)元內(nèi)，是合成5-HT的重要限速酶[5]，與5-HT的含量密切相關(guān)。故本研究擬探討柴胡疏肝散精簡方(Simplified Chaihu-Shugan Powder，SCSP)對抑郁樣大鼠中縫核內(nèi)5-HT及TPH2的影響，探究精簡方治療抑郁癥的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量180～200 g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗單位使用許可證編號：SYXK(京)2012-0023，實驗動物許可證號：SCXK(京)2014-0004，質(zhì)量檢測單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院實驗動物中心動物房飼養(yǎng)，12 h晝夜節(jié)律(8∶00至20∶00時)，室溫維持在21～23 ℃，濕度維持在30%～40%，所有實驗均在白天(9∶00至17∶00時)進行，實驗期間自由飲食飲水。

1.2 藥物

利血平注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司生產(chǎn)、批號：H12020905)；鹽酸氟西汀分散片(禮來蘇州制藥有限公司生產(chǎn)、分包裝藥品批準文號及批號：國藥準字J2012001、4145A)；柴胡疏肝散精簡方(北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；處方：柴胡9 g、白芍15 g、枳殼9 g、香附9 g；褐色免煎顆粒)；蒸餾水。

1.3 主要試劑

5-羥色胺 (5-HT，美國Sigma公司)、3,4二羥基芐胺 (DHBA，美國Sigma公司)、1-辛烷磺酸鈉、一水檸檬酸、乙腈、高氯酸、焦亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸、實驗用水18.20 MΩ超純水等。超純RNA提取試劑盒，HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒，UltraSYBR Mixture(With ROX)，DNase1，5x RNA Loading Buffer(中國康為世紀生物科技有限公司)。

1.4 主要儀器

美國ESA公司產(chǎn)品：5600A型高效液相色譜儀(ESA Model 5600A-HPLC系統(tǒng))，8通道庫侖電化學(xué)檢測器(Model 5600A Coularray Detector-8)；電極：ESA Model 6210 four channel cell, ESA Model 582型雙高壓泵，ESA Model 542全自動控溫進樣器，控制軟件：ESA Software Version 3.1。德國Sigma-2K15超速低溫離心機、MILLI-Q-B超純水器、MJ-300超聲波發(fā)生器、AG285電子分析天平、微型電動勻漿器。渦旋振蕩儀(QL-902、海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，離心機(德國Eppendorf公司)，分光光度計(美國Therno Scientific公司)，熒光定量PCR儀(杭州博日科技有限公司)。曠場軟件及配件(美國Harvard Apparatus公司)；電子秤[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]，TD3臺式低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)等。

1.5 分組及造模

實驗前進行曠場實驗，選擇水平運動總距離相近的大鼠進行實驗。采用隨機區(qū)組法分組：40只大鼠分空白組(Control)、模型組(Model)、氟西汀組(Fluoxetine)、SCSP組，每組10只。分組完成后，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周開始正式實驗。正式實驗前，按人與動物等效藥物劑量換算并參照Kulkarni等[6]方法，用蒸餾水將利血平注射液配成0.1 g/L溶液，各實驗組按照0.3 mg/kg腹腔注射；用蒸餾水將鹽酸氟西汀分散片配成0.4 g/L溶液，按成人所需劑量折算，60 kg每日劑量是20 mg，即：0.33 mg/kg，大鼠的用量一般取人用量的6～8倍作為中劑量，本次實驗按5 mL(2 mg)/kg灌胃給藥；用蒸餾水將SCSP免煎顆粒溶解，按成人所需劑量折算，按5 mL(8 g)/kg灌胃給藥；模型組灌胃等量蒸餾水，空白組予同等劑量蒸餾水腹腔注射及灌胃。腹腔注射與灌胃給藥均在每天上午9∶00至12∶00進行，連續(xù)14 d。

1.6 觀察指標

1)外觀及形態(tài)：每天實驗結(jié)束后觀察大鼠上瞼下垂1/2只數(shù)，毛發(fā)，形態(tài)(是否有震顫、豎毛、弓背樣、蜷縮樣)，大便情況等。

2)體質(zhì)量及體質(zhì)量增量：正式實驗開始后隔天稱量體質(zhì)量，計算實驗前后體質(zhì)量增量。

3)糖水偏好實驗(sucrose preference test，SPT)：參考文獻[7]并結(jié)合既往實驗進行糖水偏好實驗，實驗前給予大鼠2瓶相同的事先配好的1%(質(zhì)量分數(shù))糖水，適應(yīng)24 h；隨后換成1%(質(zhì)量分數(shù))糖水、純凈水各1瓶，適應(yīng)24 h；隨后禁食禁水24 h；隨后給予大鼠測定好質(zhì)量的糖水及純凈水各1瓶，24 h后，分別稱量剩余糖水及純凈水質(zhì)量，計算大鼠糖水攝入量、純凈水攝入量，計算糖水偏好指數(shù)。糖水偏好指數(shù)(%)=糖水攝入量/(糖水攝入量+純凈水攝入量)[8]。

4)強迫游泳實驗(forced swimming test，F(xiàn)ST)：參考文獻[9]并結(jié)合既往實驗進行強迫游泳實驗，實驗前將透明玻璃水桶(直徑15 cm，高60 cm)倒入清水，水溫計測量水溫在23～27 ℃，水深約40 cm，隨后將大鼠獨置桶內(nèi)進行強迫游泳實驗，用攝像機記錄5 min游泳錄像，隨后兩位實驗人員采用雙盲法計算大鼠游泳不動時間，取雙方記錄平均值為最終游泳不動時間結(jié)果。游泳不動時間的標準為大鼠在水中停止掙扎或漂浮的狀態(tài)，將大鼠軀體蜷縮，前爪停止刨水，偶有后爪滑動但身體保持垂直，鼻孔露出水面的時間記為游泳不動時間。

1.7 生物樣本的收集

將大鼠斷頭取血后，取出完整腦組織，迅速放入干冰中預(yù)冷，隨后取出置于-80 ℃冰箱冰凍保存?zhèn)溆?。將冰凍腦組織取出，置于切片機中，參照大鼠腦立體及平面定位圖譜進行定位，將中縫核部位腦組織取出。

1.8 中縫核內(nèi)5-HT含量的測定

以高效液相色譜-電化學(xué)法(high performance liquid chromatography-electrochemical detector，HPLC-ECD)測定中縫核內(nèi)5-HT的濃度。依次進行標準液和蛋白沉淀工作液的配制、組織樣品制備、用5-HT標準液及內(nèi)標DHBA標準液稀釋成40、20、10、5、2.5μg/L 5個不同濃度，依次測定后以對照品峰面積比內(nèi)標峰面積，對濃度進行線性回歸并計算相關(guān)系數(shù)r2，最后經(jīng)ESA軟件工作站計算出各物質(zhì)含量上樣品的測量值[10]。實際含量換算公式如下：

1.9 中縫核內(nèi)TPH2 mRNA含量的測定

以反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)法(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)測定中縫核內(nèi)TPH2的含量。依次進行引物設(shè)計、提取總樣本RNA、RNA電泳、RNA消化、反轉(zhuǎn)錄等，最后用Line Gene 9600 Plus型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。根據(jù)Real Time PCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△ct相對定量計算公式[11]。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外觀及形態(tài)

與空白組比較，模型組、氟西汀組及SCSP相繼出現(xiàn)不同程度的眼瞼下垂、毛發(fā)豎立、弓背緊張、大便偏稀。與模型組比較，氟西汀組及SCSP組上述情況發(fā)生的比例減少、程度減輕。

2.2 體質(zhì)量及體質(zhì)量增量

造模前，各組大鼠間體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模14 d后，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、體質(zhì)量增量明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，氟西汀組及SCSP組大鼠體質(zhì)量、體質(zhì)量增量明顯增加(P<0.01)，詳見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量與體質(zhì)量增量比較Tab.1 Comparison of weight and weight gain in each group

2.3 糖水偏好實驗

與空白組比較，模型組大鼠糖水偏好指數(shù)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，氟西汀組及SCSP組大鼠糖水偏好指數(shù)增加(P<0.05),詳見表2。

表2 各組大鼠糖水偏好指數(shù)比較Tab.2 Comparison of sucrose preference in each group

*P<0.01vscontrol group；#P<0.05vsmodel group;SCSP：Simplified Chaihu-Shugan Powder.

2.4 強迫游泳實驗

與空白組比較，模型組大鼠游泳不動時間明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，氟西汀組及精簡方組大鼠游泳不動時間明顯減少(P<0.01),詳見表3。

表3 各組大鼠游泳不動時間比較Tab.3 Comparison of immobility time in each group

*P<0.01vscontrol group；#P<0.01vsmodel group；SCSP：Simplified Chaihu-Shugan Powder.

2.5 中縫核內(nèi)TPH2、5-HT濃度比較

與空白組比較，模型組大鼠中縫核內(nèi)TPH2、5-HT濃度明顯減少(P<0.01)，氟西汀組及SCSP組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，氟西汀組及SCSP組大鼠中縫核內(nèi)TPH2、5-HT濃度明顯增加(P<0.01)，詳見表4。

3 討論

隨著社會的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，人們長期處于壓力之下，使得越來越多的人深受抑郁癥的困擾。中醫(yī)認為，肝郁氣滯為抑郁癥發(fā)病的基本病機，臨床以抗抑郁復(fù)方治療抑郁癥，效果顯著，其中，疏肝類中藥復(fù)方占有重要地位[12]。柴胡疏肝散精簡方是根據(jù)《景岳全書》[13]中柴胡疏肝散經(jīng)典原方，結(jié)合目前抑郁癥常見的病因病機，對組方進行精簡化裁而來，方中柴胡入足少陽、厥陰經(jīng)，在經(jīng)主氣，在臟主血，宣暢氣血，散郁調(diào)經(jīng)；白芍有養(yǎng)肝陰、調(diào)肝氣、平肝陽、緩急止痛之功效，《本草備要》[14]言其可“補血，泄肝，益脾，斂肝陰”。枳殼理氣寬中，行滯消脹,用于胸脅氣滯，脹滿疼痛[15]；香附味甘辛，氣重味輕，乃血中氣藥，諸血氣方中所必用者也，快氣開郁，逐瘀調(diào)經(jīng)[16]。四藥配伍，構(gòu)成柴胡疏肝散精簡方，具有疏肝理氣、養(yǎng)血柔肝之效。

表4 各組大鼠中縫核TPH2、5-HT濃度比較Tab.4 Comparison of the contents of TPH2 and 5-HT in raphe nucleus in each group

*P<0.01vscontrol group，#P<0.01vsmodel group；TPH2：tryptophan hydroxylase 2；5-HT：5-hydroxytryptamine；SCSP：Simplified Chaihu-Shugan Powder.

王永志等[17]發(fā)現(xiàn)，利血平腹腔注射后的模型組大鼠出現(xiàn)眼瞼下垂、毛發(fā)豎立、弓背緊張等表現(xiàn)，同時伴有體質(zhì)量下降，行為學(xué)提示其快感缺失、絕望，這與抑郁癥患者的情緒低落，易緊張焦慮，興趣喪失，悲觀絕望等狀態(tài)相似。此外，模型組中縫核內(nèi)5-HT較空白組明顯下降，這與利血平耗竭腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的藥理機制相符。腹腔注射利血平建模不僅模擬了抑郁癥患者的臨床行為表現(xiàn),更模擬了抑郁癥患者腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)系統(tǒng)功能降低的病理機制，成模迅速，模型穩(wěn)定。

同時，氟西汀組及SCSP組較模型組體質(zhì)量、體質(zhì)量增量、糖水偏好指數(shù)增加，說明氟西汀和精簡方均可改善抑郁樣大鼠的抑郁樣狀態(tài)，說明兩者均具有一定的抗抑郁作用，可對其機制進行進一步分析。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說認為5-HT的絕對或相對缺乏是抑郁癥發(fā)病的重要因素，中縫核是單胺能中心傳遞信息的核心腦區(qū)[18-19]，是產(chǎn)生5-HT的主要區(qū)域。5-HT主要由中縫核內(nèi)5-HT能神經(jīng)元內(nèi)的色氨酸在TPH2的作用下生成，TPH2是5-HT生成過程中重要的限速酶。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，氟西汀組及SCSP組中縫核內(nèi)5-HT濃度較模型組均明顯增多，說明兩者均通過某種途徑增加了中縫核內(nèi)5-HT濃度。此次實驗中氟西汀組、SCSP組與模型組比較可以看出，氟西汀組、SCSP組TPH2濃度較模型組明顯增多，由此可推斷，氟西汀、SCSP可增加中縫核內(nèi)TPH2濃度從而促進色氨酸更多的轉(zhuǎn)化為5-HT，進而使中縫核內(nèi)5-HT濃度增加，發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上所述，SCSP可明顯改善利血平致抑郁樣大鼠的抑郁狀態(tài)，與陽性對照藥氟西汀效果相當，這可能與其增加中縫核內(nèi)TPH2的濃度使得5-HT濃度增加相關(guān)。