紫甘藍(lán)總花色苷提取物抑制脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)

譚兵，龐琪期，錢波,3，王程強(qiáng),3，曾榛,3，周燕園，宋家樂,3

（1.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541100）(2.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林 541100)

(3.廣西高校預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣西桂林 541100)(4.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541100）

紫甘藍(lán)又名紫包菜、紫卷心菜、紅甘藍(lán)，屬十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種甘藍(lán)變種，通體呈紫紅色，易于栽種且營養(yǎng)價值頗高[1]。目前，植物類花色苷由于其自身所具有的抗氧化、抗衰老、調(diào)控血脂、預(yù)防冠心病等多種生物活性而成為了營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。但目前對于花色苷的研究主要針對水果與豆科類植物中的藍(lán)莓、櫻桃、桑葚[2～5]及黑豆和黑米等而進(jìn)行[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，紫甘藍(lán)中富含的花青素類物質(zhì)具有抗氧化、抗突變、預(yù)防心血管疾病、保護(hù)肝臟、抗腫瘤細(xì)胞等多種生理功能[8]。

炎癥反應(yīng)是一種非特異性免疫反應(yīng)，正常水平的炎癥反應(yīng)是機(jī)體對抗外界刺激所做出的生理反應(yīng)。但過度的炎癥反應(yīng)則是多種疾病發(fā)生的重要危險因素之一。屬于機(jī)體免疫體系中重要免疫細(xì)胞的巨噬細(xì)胞可防止外界病原物質(zhì)(細(xì)菌，病毒和真菌)的侵入[9,10]?；罨蟮木奘杉?xì)胞在炎癥反應(yīng)過程中，可通過激活自身體內(nèi)的炎性介質(zhì)酶如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)等炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)白介素-1β (IL-1β)，IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎細(xì)胞因子的分泌，使其參與到機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中[11]。但是，由于多種原因所引起的免疫失調(diào)而所導(dǎo)致機(jī)體過度分泌的炎癥細(xì)胞因子會引發(fā)細(xì)胞壞死，組織損傷和退化，并因此加重炎癥，從而危及機(jī)體健康[12]。

國內(nèi)外目前對于紫甘藍(lán)主要在其色素提取工藝、色素抗氧化能力等方面有較多的研究報道。而就紫甘藍(lán)總花色苷抗炎作用的研究鮮見報道。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是常見致病性革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的內(nèi)毒素成分，是誘發(fā)免疫反應(yīng)的主要因素[13]。因此，本實驗擬利用脂多糖(1 μg/mL)誘導(dǎo)RAW264.7小鼠單核白血病巨噬細(xì)胞制備細(xì)胞炎癥模型，以此研究紫甘藍(lán)總花色苷對細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，討論其可能的機(jī)制，并為紫甘藍(lán)的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘藍(lán)采購自桂林市蔬菜科學(xué)研究所。DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清，美國Gibco公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶-EDTA消化液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，美國 Thermo Scientific公司；Trizol試劑、OligodT18、RNase、dNTP、MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，美國Invitrogen公司；ROX reference Dye和SYBR Premix Ex Taq II，大連寶生物工程公司；大腸桿菌脂多糖(LPS)，美國 Sigma-Aldrich公司；IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 試劑盒，美國 Cloud colon公司；一氧化氮(NO)和前列腺素E2 (PGE2)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

723型紫外分光光度計，上海精科實業(yè)有限公司；EYELA N-1001S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會社；三洋 MCO-15AC二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本三洋公司；Centrifuge 5418R冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Biotek Elx808酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀，德國BMG公司。Quant Studio TM 6 Flex PCR儀，美國Applied Biosystems公司。

1.3 實驗細(xì)胞株

小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞株 RAW 264.7購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(編號：KCB200603 YJ)。

1.4 紫甘藍(lán)總花色苷的制備

新鮮紫甘藍(lán)的可食部清洗除雜后，真空冷凍干燥，粉碎，過60目篩備用。紫甘藍(lán)粉(10 g)中加入200 mL酸化乙醇溶液(80% V/V，pH 3.0)后在室溫條件下攪拌浸提5 h。濾液經(jīng)3000×g離心15 min后棄渣收集上清，30 ℃真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制備濃縮提取物。使用D-101大孔樹脂吸附濃縮液，并用去離子水反復(fù)沖洗樹脂除雜數(shù)次后。使用前述酸化乙醇溶液注入大孔樹脂中吸附目標(biāo)產(chǎn)物1 h，收集液體，30 ℃真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制備濃縮提取物，最終制成紫甘藍(lán)總花色苷提取物(RCTA)，-80 ℃儲存待用。

1.5 紫甘藍(lán)提取物中總花色苷濃度的測定

在具塞比色管中加入4.5 mL的KCl-HCl緩沖液(25 mmol/L，pH 1.0)或4.5 mL的醋酸鈉-醋酸緩沖液(400 mmol/L，pH 4.5)后，分別加入0.5 mL的紫甘藍(lán)總花色苷提取物，室溫放置20 min。分別測定530 nm和700 nm處的吸光度后，依照公式：A=(A530-A700)pH1.0-(A530-A700)pH4.5計算總花色苷的吸光度。然后依照公式總花色苷濃度(mg/mL)=A×Mw×DF/ε×L 計算實際樣品中的花色苷濃度。其中 Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量(449.2 g/mol)；DF為稀釋因子(10)；ε是矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾吸收系數(shù)[26900 L/(mol·cm)]；L為比色杯光程(1 cm)。經(jīng)該法測定提取物中總花色苷含量為174.35±4.29 mg/g。

細(xì)胞接種到6孔板并按1.6.1方法分組處理，細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為2×105個/mL，每孔2 mL，進(jìn)行24 h培養(yǎng)后，以不同質(zhì)量濃度的紫甘藍(lán)總花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)作用細(xì)胞，設(shè)置空白對照組、LPS組及LPS+紫甘藍(lán)總花色苷提取物組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在4 ℃下收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。取適量培養(yǎng)上清液按照TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8測定試劑盒說明書步驟操作。

1.6 紫甘藍(lán)總花色苷提取物對細(xì)胞炎癥的作用

1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

1.6.4 qRT-PCR法測定 RAW264.7細(xì)胞內(nèi)iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-8的mRNA表達(dá)

RAW264.7細(xì)胞用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%FBS與1%青-鏈霉素雙抗液)置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下濕化培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁長至培養(yǎng)皿80%時，用胰蛋白酶-EDTA液按比例消化傳代，取指數(shù)期細(xì)胞用于實驗。以DMEM培養(yǎng)液(含LPS：1 μg/mL)處理細(xì)胞24 h制備細(xì)胞模型。模型細(xì)胞以紫甘藍(lán)總花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h并進(jìn)行后續(xù)實驗。對照組為未經(jīng)過任何處理的正常RAW264.7細(xì)胞。

1.6.2 RAW264.7細(xì)胞分泌NO和PGE2水平的檢測

細(xì)胞按照前述方法分組處理并將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為2×105個/mL接種于24孔板，每孔接種1 mL，進(jìn)行24 h培養(yǎng)后，以不同質(zhì)量濃度的紫甘藍(lán)總花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)處理細(xì)胞，設(shè)置空白對照組、LPS組及LPS+紫甘藍(lán)總花色苷提取物組，每組4個復(fù)孔，24 h后，按試劑盒說明書操作測定細(xì)胞培養(yǎng)基中NO和PGE2的含量。

按 1.6.1方法分組處理并將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為2×105個/mL接種于6孔板，每孔2 mL，進(jìn)行24 h培養(yǎng)后，同時以不同質(zhì)量濃度的紫甘藍(lán)總花色苷提取物(1 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL)作用細(xì)胞，設(shè)置空白對照組、LPS組及LPS+紫甘藍(lán)總花色苷提取物組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。12000 r/min離心5 min，棄上清，Trizol試劑盒法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，紫外分光檢測提純后的RNA濃度用于后續(xù)實驗。取總RNA(2 μg)加入 dNTPs(1 μL)、OligodT18 引物(1 μL)、MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(1 μL)、RNases抑制劑(1 μL)及 5×Buffer (10 μL)逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。取適量cDNA(2 μL)用 qRT-PCR 法檢測 iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表達(dá)水平。在總反應(yīng)體系中(20 μL)加入上游和下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq II (10 μL)、50×ROX reference Dye(0.4 μL)和滅菌雙蒸水(5.6 μL)，充分混勻后置于PCR儀中反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，72 ℃延伸2 min。每個基因cDNA樣本平行擴(kuò)增3次，取Ct值均數(shù)，依公式計算目的基因表達(dá)量各引物序列見表1。

表1 引物序列表Table 1 Sequences of primers

1.6.3 模型細(xì)胞中細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌水平的測定

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本研究中，所有實驗均重復(fù) 3次，結(jié)果以均值(means)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。所得實驗數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析與統(tǒng)計處理，p＜0.05為具有統(tǒng)計差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫甘藍(lán)總花色苷對 LPS處理 RAW264.7細(xì)胞分泌NO和PGE2水平的影響

圖1 紫甘藍(lán)總花色苷對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌NO和PGE2水平的影響Fig.1 Effects of RCTA on NO and PGE2 levels in LPS treated RAW264.7 cells

如圖1示，與正常組相比，RAW264.7細(xì)胞在經(jīng)LPS(1 μg/mL)處理后細(xì)胞分泌NO和PGE2的釋放量顯著升高(p＜0.05)。與 LPS組相比，紫甘藍(lán)總花色苷提取物各組均能顯著抑制 LPS處理所引起的NO與PGE2水平的釋放。NO是人體內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要分子，能參與細(xì)胞間、細(xì)胞內(nèi)以及神經(jīng)和心血管系統(tǒng)的生理調(diào)節(jié)。在炎癥反應(yīng)中，NO具有一定的毒性作用，不僅能夠損傷DNA還參與NO介導(dǎo)的組織損傷作用，導(dǎo)致水腫和血滲出[14]。圖 1所示，LPS刺激組的RAW264.7細(xì)胞中NO濃度顯著高于正常對照組。而在紫甘藍(lán)總花色苷提取物作用組中、高劑量（10 μg/mL和50 μg/mL）組的NO釋放濃度顯著低于LPS模型組(抑制率分別為 36.11%和 58.51%)。PGE2也是一種常見的炎癥介質(zhì)，其參與關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎（癌）和肝炎（癌）等疾病過程中的多種炎癥反應(yīng)。相反，抑制PGE2的產(chǎn)生可減輕炎癥癥狀[15]。經(jīng)紫甘藍(lán)總花色苷提取物作用模型細(xì)胞后，細(xì)胞 PGE2的溢出水平均得到顯著抑制。紫甘藍(lán)總花色苷提取物(10 μg/mL和50 μg/mL)處理后細(xì)胞PGE2溢出水平分別較未經(jīng)處理LPS模型細(xì)胞分泌水平降低29.58%和46.26%上結(jié)果說明，紫甘藍(lán)總花色苷提取物能夠有效抑制 LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型分泌NO和PGE2水平，具有較好抗炎效果。

2.2 甘藍(lán)總花色苷提取物對 LPS處理RAW264.7細(xì)胞中iNOS和COX-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

圖2 紫甘藍(lán)總花色苷對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中iNOS和COX-2的mRNA表達(dá)水平影響Fig.2 Effects of RCTA on mRNA expression of iNOS and COX-2 in LPS treated RAW264.7 cells

iNOS在炎癥和免疫反應(yīng)刺激下，通過催化L-精氨酸并進(jìn)行氧化脫氨作用最終導(dǎo)致 NO的產(chǎn)生。而COX-2是參與PGE2生物合成的關(guān)鍵酶，在炎性因子介導(dǎo)下COX-2表達(dá)會異常增高[16]。如圖2示，與LPS組相比，紫甘藍(lán)總花苷提取物各組均能顯著抑制iNOS和COX-2的mRNA表達(dá)。較未經(jīng)紫甘藍(lán)總花色苷提取物處理過的LPS模型組細(xì)胞而言，紫甘藍(lán)總花色苷提取物(10 μg/mL和50 μg/mL)能夠分別有效降低LPS模型細(xì)胞中iNOS的轉(zhuǎn)錄水平40.37%和65.80%。同時，紫甘藍(lán)總花色苷提取物還能顯著抑制LPS模型細(xì)胞中COX-2的轉(zhuǎn)錄水平22.47%和48.28%。抑制iNOS的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)控NO分泌水平；抑制COX-2的表達(dá)，下調(diào) PGE2的生物合成，可在抑制致炎細(xì)胞因子表達(dá)的同時發(fā)揮抗炎效果[17]。

2.3 紫甘藍(lán)總花色苷提取物對 LPS處理RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌水平的影響

TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8是常見的炎癥細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞遷徙、刺激炎癥因子的釋放、激化氧化應(yīng)激反應(yīng)，并直接導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損傷[18,19]。如圖3示，與對照組相比，LPS(1 μg/mL)刺激可顯著增加RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的分泌，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。不同濃度(1 μg/mL、10 μg/mL 和 50 μg/mL)紫甘藍(lán)總花色苷提取物干預(yù)模型細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的分泌水平均得到顯著抑制，且隨著紫甘藍(lán)總花色苷提取物濃度的增加，模型細(xì)胞上清液中各檢測因子的濃度呈趨勢下降。50 μg/mL紫甘藍(lán)總花色苷提取物對模型細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌抑制效果最佳，抑制率為36.90%、73.02%、55.87%和58.46%。

2.4 紫甘藍(lán)總花色苷提取物對 LPS處理RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

炎癥細(xì)胞因子通常是由單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，起介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。當(dāng)機(jī)體受到免疫應(yīng)激或化學(xué)刺激時，會導(dǎo)致其過度分泌從而引起炎癥反應(yīng)或病理損傷[20]。如圖4示，與LPS組相比，經(jīng)紫甘藍(lán)總花色苷提取物處理后的模型細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)水平呈顯著降低趨勢(p＜0.05)。當(dāng)紫甘藍(lán)總花色苷提取物濃度達(dá)到50 μg/mL時，細(xì)胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的 mRNA表達(dá)水平分別較未處理的模型細(xì)胞相比下降65.26%、65.84%、68.16%和44.25%。

圖3 紫甘藍(lán)總花色苷對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平的影響Fig.3 Effects of RBTA on TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-8 levels in LPS treated RAW264.7 cells

圖4 紫甘藍(lán)總花色苷對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表達(dá)水平影響Fig.4 Effects of RCTA on mRNA expression of TNF-α, IL-1β,IL-6 and IL-8 in LPS treated RAW264.7 cells

3 結(jié)論

本研究以LPS所誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥細(xì)胞模型來研究紫甘藍(lán)總花色苷提取物對細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控效果。實驗結(jié)果證實，紫甘藍(lán)總花色苷提取物能夠抑制炎癥模型細(xì)胞中炎性介質(zhì)(NO和PGE2)，并同時抑制 LPS所誘發(fā)模型細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-8)的分泌，以此降低細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。而從分子機(jī)制方面，紫甘藍(lán)總花色苷能夠有效的抑制模型細(xì)胞中炎性介質(zhì)酶(iNOS和COX-2)的表達(dá)，并對TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等炎性因子的基因轉(zhuǎn)錄呈抑制調(diào)控作用。在日后的研究中，課題組將從經(jīng)典的 NF-кB通路層面來探討紫甘藍(lán)總花色苷對細(xì)胞炎癥反應(yīng)的信號調(diào)控機(jī)制。