超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定保健食品中14種功效成分

楊惠成，王海鳴，林緒，燕云，何曉峰

（廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣東廣州 510065）

隨著人類生活水平的提高，人們已經(jīng)不再滿足于吃飽穿暖，而是更加關(guān)注于飲食健康，通過飲食改善自身的身體狀況，營養(yǎng)保健成為更多人關(guān)注的焦點。保健品作為一種特殊的食品，旨在調(diào)節(jié)人體功能，補充人體所需的營養(yǎng)素。自保健品問世以來，受到很多消費者的青睞。保健品也獲得了快速發(fā)展，產(chǎn)品琳瑯滿目。然而有許多不法商家為了謀取暴利，制造各種各樣的劣質(zhì)保健品，使我國的保健食品市場存在很多安全隱患，急需開展快速檢測保健食品的質(zhì)量的方法。

功效成分是保健食品功能保健功能的關(guān)鍵所在，也是產(chǎn)品質(zhì)量的主要指標(biāo)，因此功效成分檢測便成為國內(nèi)外保健食品開發(fā)研究十分重視的一個環(huán)節(jié)。要使保健食品長期穩(wěn)定的健康發(fā)展，弄清其功效成分并解決測定方法有著重要的意義[1]?，F(xiàn)有的保健食品功效成分的檢測方法有分光光度法[2]、氣相色譜法[2]、高效液相色譜法[3～17]、液相色譜-質(zhì)譜法[18]等，其中高效液相色譜法為最常見的檢測方法，但檢測項目單一，對于含有多種功效成分的保健食品，由于基質(zhì)的干擾和某些目標(biāo)物缺乏較強的紫外或熒光吸收，導(dǎo)致檢測效果不佳，故難以實現(xiàn)多組分的同時測定，而且其靈敏度也無法達到對相關(guān)提取物中低濃度樣品的分析。因此，本文利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)勢，建立準(zhǔn)確、快速測定保健食品中14種功效成分同時測定的分析方法，不僅可以對單一組分不同功能的各類保健食品提供一種優(yōu)良的檢測方法，而且還可以對多種功效成分的保健食品建立一種檢測方法，為保健食品的生產(chǎn)研發(fā)和監(jiān)管提供高效靈敏的定性定量檢測手段。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純），乙酸銨（分析純）：默克公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：綠原酸（Chlorogenic acid，327-97-9，97.2%）、沒食子酸（Gallic acid，149-91-7，99.47%）、丹參素鈉（Sodium Danshensu，67920-52-9，98.1%）、蘆薈苷（Barbaloin，1415-73-2，94.4%）、白藜蘆醇（Resveratro，501-36-0，99.4%）、紅景天苷（Salidroside，10338-51-9，98.8%）、蘆?。≧utinum，153-18-4，99.3%）、淫羊藿苷（Icariin，489-32-7，94.2%）、苦杏仁苷（Semen Armeniacae Amarum，29883-15-6，90.7%）、芍藥苷（Paeoniflorin，23180-57-6，95.7%）、黃氏甲苷（Astragaloside，84687-43-4，97.4%）、腺苷（Adenosine，58-61-7，99.7%）、甘草酸（Glycyrrhizic acid，1405-86-3，93.0%）、大蒜素（Allicin，539-86-6，97.3%）：SIGMA公司。

1.2 儀器設(shè)備

AB4500超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國SCIEX公司），超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），ME203E電子分析天平（瑞士梅特勒），XS205DU電子分析天平（瑞士梅特勒）。

1.3 試劑配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)20 mg，分別置于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，配成2.0 mg/mL單個標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液

由于各目標(biāo)化合物在儀器的響應(yīng)值存在差異，因此需要配置不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，配成濃度分別為100 μg/mL，10 μg/mL，1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)使用液

用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)使用液。綠原酸、沒食子酸、丹參素鈉、白藜蘆醇、紅景天苷、黃氏甲苷、甘草酸、大蒜素的質(zhì)量濃度為 1000 ng/mL、500 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL；蘆丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍藥苷的質(zhì)量濃度為100 ng/mL、50 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0.5 ng/mL；蘆薈苷、腺苷的質(zhì)量濃度為 10 ng/mL、5 ng/mL、2 ng/mL、1 ng/mL、0.5 ng/mL、0.1 ng/mL、0.05 ng/mL。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取各類樣品2.00 g，至100 mL容量瓶中，加入甲醇50 mL，超聲提取15 min，冷卻后，用甲醇定容至刻度，經(jīng)0.22 μm濾頭過濾，濾液作為測試液。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18 （100 mm×2.1 mm，3 μm）；流動相A：0.1%甲酸水，流動相B：乙腈，流動相梯度：0～3 min，10% B保持不變，3～5 min，90%B保持不變；5～7 min，10% B保持不變；樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。

1.4.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）源；正離子負(fù)離子交替掃描；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；氣簾氣流量：30 L/min；霧化氣流量：50 L/min；輔助加熱氣流量：50 L/min；碰撞氣：Medium；輔助加熱氣溫度：500 ℃；噴霧電壓：5000 V（ESI+）/-4500 V（ESI-）；離子源溫度：500 ℃。

表1 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 MRM parameters for tandem mass spectrometry

1.4.4 線性關(guān)系

用空白樣品基質(zhì)作為溶劑，配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.22 μm微孔針頭濾膜過濾，由低濃度至高濃度進行 HPLC-MS/MS分析，每個濃度重復(fù) 3次，繪制峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算線性范圍，相關(guān)系數(shù)，精密度和以信噪比 RSN=3對應(yīng)質(zhì)量濃度確定檢出限。

1.4.5 回收率

取2份同一樣品提取液1 mL，其中1份用甲醇定容至100 mL，另一份加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液再用甲醇定容至100 mL。在同樣色譜條件下進樣檢測6次，根據(jù)加標(biāo)濃度前后的變化及加標(biāo)量計算回收率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用 SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，ANOVE進行方差分析，Duncan對提取條件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲時間的選擇

通過查閱資料得知，14種功效成分均是醇溶性物質(zhì)，其中蘆丁溶于甲醇，微溶于乙醇。因此，本文采用甲醇作為提取溶劑。超聲時間對靈芝膠囊中功效成分提取濃度的影響如表2所示，在5～15 min時，提取時間對靈芝膠囊中所含功效成分的提取濃度逐漸增大，且差異性顯著（p＜0.05）。在15～20 min時，超聲時間對靈芝膠囊功效成分的濃度隨之下降，但差異性不顯著。

超聲時間對靈芝膠囊中 14種功效成分加標(biāo)回收率的影響如表3所示，取靈芝膠囊，添加2 μg/kg、20 μg/kg、200 μg/kg三個濃度混合標(biāo)準(zhǔn)液進行超聲處理。由表3可知，超聲時間為5 min、10 min、15 min、20 min，14種化合物的回收率范圍分別為75.90%～85.03%、82.03%～98.81%、86.83%～108.44%、86.95%～108.02%?；衔镌诔晻r間為在5 min至15 min之間，隨著提取時間的延長，化合物的回收率增大。超聲時間在20 min時的回收率與15 min時的回收率沒有顯著性差異（p＞0.05）。因此，本文選用15 min作為超聲時間。

表2 超聲時間對靈芝膠囊功效成分提取濃度的影響Table 2 Effect of ultrasonic time on the concentration of effective components in Ganoderma lucidum capsules (n=3)

表3 超聲時間對功效成分加標(biāo)回收率的影響Table 3 Effect of ultrasonic time on recovery rate of functional ingredients (n=3)

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

大蒜素、甘草酸、腺苷、黃氏甲苷在Q1 MS負(fù)離子模式下，響應(yīng)較低，達不到檢出限要求，在正離子模式下形成[M+H]+峰，響應(yīng)較高；綠原酸、沒食子酸、蘆薈苷、白藜蘆醇、紅景天苷、蘆丁在Q1 MS負(fù)離子模式下形成的[M-H]-峰響應(yīng)最高；淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍藥苷在Q1 MS負(fù)離子模式下形成的[M+HCOO]-峰響應(yīng)最高，因此采用正負(fù)離子交替掃描的方式進行試驗。調(diào)節(jié)CE參數(shù)，使母離子的強度占子離子強度的1/3～1/4為最佳，從質(zhì)譜圖中選擇1個信號較強的子離子作為定性離子，離子豐度最強的子離子為定量離子，采用針泵流動注射標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行參數(shù)優(yōu)化。質(zhì)譜參數(shù)確定后，連接液相色譜進樣，由于各物質(zhì)的離子源溫度、輔助加熱氣、干燥氣、氣簾氣、電噴霧電壓等參數(shù)與在單純質(zhì)譜條件下發(fā)生變化，因此選擇適中的一組參數(shù)在液相條件下進行再優(yōu)化，最終得到最佳的去簇能量（DP）和碰撞能量（CE）。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

本方法比較了乙酸銨水溶液-乙腈流動相體系和甲酸水溶液-乙腈流動相體系的分離效果，發(fā)現(xiàn)兩者所得的峰形對稱，目標(biāo)化合物均在5 min內(nèi)檢出，但兩者在響應(yīng)值指標(biāo)上甲酸水-乙腈體系優(yōu)于乙酸銨-乙腈體系，故而本方法采用甲酸水溶液-乙腈作為流動相。圖1為分別采用0.1%甲酸水-乙腈和5 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相時對14種目標(biāo)化合物的響應(yīng)值。

在流動相中加酸可抑制電離、改善峰形，但酸濃度過高會抑制在負(fù)離子模式下的離子化效率。同時考慮到 0.1%的甲酸水溶液已經(jīng)足以滿足檢出限（見2.5.1）響應(yīng)的要求，過高濃度的酸溶液對色譜柱壽命有一定的影響，且不利于離子源中溶劑的高效脫除，所以最終選擇了 0.1%的甲酸水溶液-乙腈作為流動相。

圖1 相同濃度的目標(biāo)化合物在不同流動相中的響應(yīng)值Fig.1 Response values in different mobile phase

2.4 功效成分離子色譜圖

功效成分提取離子色譜圖見圖2。由圖2可以看出，采用2.2和2.3確定的質(zhì)譜條件和色譜條件，14種目標(biāo)化合物均在4 min內(nèi)完成出峰，大部分物質(zhì)可以較好的進行分離，綠原酸、蘆丁、苦杏仁苷和大蒜素，白藜蘆醇和黃氏甲苷無法較好的分離。同時，由于采用MS/MS檢測器，通過MRM模式進行檢測14種目標(biāo)化合物的特征離子對，對沒有完全分離的組分，仍可以進行準(zhǔn)確定性及定量。結(jié)果表明，該色譜條件和質(zhì)譜條件適宜14種目標(biāo)化合物的分析。

圖2 14種植物功效成分的提取離子色譜圖Fig.2 Extraction ion chromatography of 14 kinds of functional components

2.5 方法驗證

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限、定量限

由于保健食品均含有一種或多種功效成分，其成分較為復(fù)雜（如肽類、糖類、脂類等），用甲醇提取后，仍含有各種有機物，這些物質(zhì)與目標(biāo)化合物共流出色譜柱進入電離源時，將嚴(yán)重影響目標(biāo)化合物的離子化過程，對目標(biāo)物的信號產(chǎn)生抑制或增強的效果。保健品基質(zhì)對14種功效成分的影響如表4所示，由表可知，標(biāo)液在空白基質(zhì)中的峰面積與標(biāo)液在流動相中的峰面積的比值均小于1.0，說明保健食品的基質(zhì)對功效成分具有離子抑制效應(yīng)。

為了消除基質(zhì)帶來的離子抑制效應(yīng)對定量測定的影響，試驗采用空白樣品基質(zhì)作為溶劑，配制適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。綠原酸、沒食子酸、丹參素鈉、白藜蘆醇、紅景天苷、黃氏甲苷、甘草酸、大蒜素在5～1000 ng/mL，蘆丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍藥苷在0.5～100 ng/mL，蘆薈苷、腺苷在0.05～10 ng/mL，依次進樣，以14種目標(biāo)峰的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，分別得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程，按3倍信噪比確定方法的檢出限，10倍信噪比確定方法的定量限。結(jié)果表明：采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線能有效減少基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響，范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均＞0.998。綠原酸、沒食子酸、丹參素鈉、白藜蘆醇、紅景天苷、黃氏甲苷、甘草酸、大蒜素檢出限為75 μg/kg，蘆薈苷、腺苷檢出限為0.75 μg/kg，蘆丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍藥苷檢出限為7.5 μg/kg。14種功效成分的線性方程、線性系數(shù)、檢出限和定量限等參數(shù)見表5。

表4 保健食品基質(zhì)對功效成分的影響Table 4 Effect of health food substrates on functional ingredients

表5 14種化合物的線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 5 Linearity, detection, and quantification limits for 14 kinds of functional components

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黃氏甲苷 y=102.05504x+37.73299 0.9986 5～1000 75 250腺苷 y=6.61679e4x+2626.86279 0.9991 0.05～10 0.75 2.5甘草酸 y=1640.93776x+3345.41165 0.9983 5～1000 75 250大蒜素 y=4120.93650x+14471.76835 0.9990 5～1000 75 250

2.5.2 方法的回收率和精密度

取靈芝膠囊、藏域紅天膠囊、蟲草菌絲體口服液添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液得綠原酸、沒食子酸、丹參素鈉、白藜蘆醇、紅景天苷、黃氏甲苷、甘草酸、大蒜素濃度為 100 μg/kg、200 μg/kg、500 μg/kg；蘆薈苷、腺苷濃度為 1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg；蘆丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍藥苷濃度為 10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg，每個濃度6個平行，按照1.4.5的方式進行添加實驗。檢測結(jié)果在1 μg/kg～500 μg/kg濃度范圍內(nèi)，扣除空白值后，加標(biāo)回收率在83.42%～108.44%范圍內(nèi)，所有目標(biāo)峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%，詳見表6。

表6 方法準(zhǔn)確度和精密度Table 6 Accuracy and precision for 14 kinds of functional components

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黃氏甲苷腺苷甘草酸100 92.94 3.29 103.20 1.99 83.42 2.98 200 92.56 2.10 98.92 1.98 90.08 1.49 500 91.30 2.10 100.21 3.43 86.53 2.05 1 107.64 2.96 91.23 1.08 91.82 3.57 2 106.32 4.43 99.08 2.00 87.84 1.77 5 103.64 3.86 90.54 1.76 101.06 4.55 100 105.22 2.05 90.94 1.86 93.67 4.65 200 104.02 2.67 94.26 3.90 86.83 2.35 500 102.53 3.01 95.65 2.94 94.18 1.60大蒜素100 92.91 1.52 91.23 1.97 88.67 1.15 200 105.04 1.79 88.82 2.29 88.49 2.31 500 97.16 1.09 86.34 1.86 8706 1 99

2.5.3 樣品適用性實驗

圖3 不同樣品的植物功效成分的總離子流色譜圖Fig.3 TIC of functional components in different samples

用本方法對市售的保健食品（洋參淫羊藿軟膠囊、蟲草菌絲體口服液、紅景天參杞?；撬峥诜海┻M行檢測，分別檢測出淫羊藿苷（18.0 g/kg，該洋參淫羊藿軟膠囊中淫羊藿苷的濃度較高，在前處理過程中，將測試液逐級稀釋4000倍后上機測定）、腺苷（0.12 g/kg）、紅景天苷（2.4 g/kg），受干擾小，分析速度快（分析時間小于4 min），實現(xiàn)了一種方法適用于多種保健食品的功效成分的檢測，離子色譜圖見圖3。

3 結(jié)論

3.1 本文通過對保健食品中綠原酸、沒食子酸、丹參素鈉、白藜蘆醇、紅景天苷、黃氏甲苷、甘草酸、大蒜素、蘆丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍藥苷、蘆薈苷、腺苷檢測條件的探索，當(dāng)甲醇提取，超聲15 min，流動相為 0.1%的甲酸水溶液-乙腈，正負(fù)離子交替掃描時檢測條件最佳。該方法能在4 min內(nèi)完成出峰，能很好的將14種植物功效成分分離，以信噪比為3和10分別計算出14種功效成分的檢出限及定量限，其中綠原酸、沒食子酸、丹參素鈉、白藜蘆醇、紅景天苷、黃氏甲苷、甘草酸、大蒜素檢出限為75 μg/kg，定量限為 250 μg/kg；蘆薈苷、腺苷檢出限為 0.75 μg/kg，定量限為2.5 μg/kg；蘆丁、淫羊藿苷、苦杏仁苷、芍藥苷檢出限為7.5 μg/kg，定量限為25 μg/kg。

3.2 對于保健食品中多種功效成分同時測定的方法一直是國內(nèi)學(xué)者研究的方向，本文建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定保健食品中植物功效成分的檢測方法，本方法具有前處理簡單，快捷簡便、高效高通量等特點，可為含有多種功效成分的保健食品的生產(chǎn)、研發(fā)及質(zhì)量監(jiān)控提供高效、準(zhǔn)確和靈敏的檢測手段。