黑皮質(zhì)素受體-4在正常大鼠瘦素誘發(fā)交感神經(jīng)活性和壓力感受性反射功能變化中的作用

李寶新，田茜，張?jiān)屏迹Ｎ凝?，王翯，李娜，郭淑芹

(1保定市第一中心醫(yī)院，河北保定071000；2河北醫(yī)科大學(xué))

近年高血壓發(fā)病率逐年升高，已成為重大公共衛(wèi)生問題之一，探究高血壓發(fā)病機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)[1]。交感神經(jīng)活性(SNA)的增加是高血壓發(fā)病的原因之一[2]，瘦素(LPN)作為一種調(diào)節(jié)能量代謝、食欲和生理的神經(jīng)內(nèi)分泌因子，可以通過影響交感神經(jīng)活性、腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)、壓力感受性反射功能等參與高血壓發(fā)生發(fā)展[3]。已有研究報(bào)道,LPN和其下游因子α-促黑素細(xì)胞刺激素(α-MSH)可以影響食欲中樞，α-MSH結(jié)合黑皮質(zhì)素受體-4(MC4R)后可以抑制進(jìn)食量[4]。研究發(fā)現(xiàn)MC4R能夠調(diào)節(jié)葡萄糖耐量和交感神經(jīng)活性[5,6]，從而增加患高血壓的風(fēng)險(xiǎn)，LPN是否可以通過MC4R進(jìn)而調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性尚不清楚。本研究通過對(duì)大鼠側(cè)腦室注射LPN，觀察SNA變化，并在室旁核(PVN)顯微注射MC4R抑制劑SHU9119，探討其對(duì)LPN引起的交感神經(jīng)活性和壓力感受性反射功能變化的影響及MC4R在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇SD雄性大鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證編號(hào)：11400700150970)20只，220～250 g,飼養(yǎng)于河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物室，室內(nèi)通風(fēng)良好，室溫保持在18～20 ℃。基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。Biopac MP100 數(shù)據(jù)獲得和分析系統(tǒng)(美國(guó)Biopac Systems公司)，α-氯醛糖(美國(guó)Sigma公司)，異氟醚(美國(guó)Sigma公司)，LPN(美國(guó)R&D Systems公司)，SHU9119(英國(guó)Tocris Bioscience公司)。

1.2 股動(dòng)靜脈插管及定位 應(yīng)用5%異氟醚誘導(dǎo)麻醉，氧氣吸入后逐漸減為2%異氟醚維持，使用直腸熱敏電阻監(jiān)測(cè)，體溫保持在(37±1)℃。氣管插管保持人工通氣，然后股動(dòng)脈(1支)和股靜脈(3支)導(dǎo)管植入用于監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓和藥物注射。在下腹部取正中切口，找到腰椎神經(jīng)，固定神經(jīng)后以電腦顯示出現(xiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)信號(hào)為準(zhǔn)，然后應(yīng)用立體定位儀定位側(cè)腦室及PVN注射部位，大鼠需穩(wěn)定60 min以上開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 動(dòng)物分組及處理 將SD大鼠20只隨機(jī)分為PVN-aCSF組和PVN-SHU9119組，每組10只。首先進(jìn)行側(cè)腦室定位：應(yīng)用立體定位儀定位大鼠頭部，使其暴露出扁平的頭骨，使用前囟和硬膜的背表面為基準(zhǔn)(計(jì)為零)，坐標(biāo)如下(毫米前囟)：尾1.0 mm，側(cè)1.4 mm，背4.2 mm，玻璃移液管用于側(cè)腦室注射LPN(5 μg/h)。其次進(jìn)行PVN定位用于注射SHU9119 (0.5 mmol/L)或人工腦脊液(aCSF)：使用微量移液管在顯微鏡下進(jìn)行PVN藥物注射，仍使用前囟和硬膜的背表面為基準(zhǔn)(計(jì)為零)，坐標(biāo)定位：尾側(cè)1.8～2.0 mm, 外側(cè)0.5 mm，腹側(cè)7.4 mm。aCSF配制：氯化鈉、氯化鉀2.6 mmol/L，氯化鈣1.3 mmol/L，氯化鎂0.9 mmol/L，碳酸氫鈉20 mmol/L，磷酸氫二鈉1.3 mmol/L，葡萄糖2.0 mmol/L，pH為7.4。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將2.5%阿利新藍(lán)溶解在醋酸鈉中注入100 nL，去除腦后發(fā)現(xiàn)腦室有染料存在，證實(shí)注射部位正確。兩組均在手術(shù)后穩(wěn)定1 h,繪制0 h壓力感受性反射曲線，然后均在側(cè)腦室注射LPN 1 h，繪制1 h LPN壓力感受性反射曲線；大鼠穩(wěn)定后繼續(xù)注射LPN的同時(shí)分別在雙側(cè)PVN顯微注射aCSF和MC4R抑制劑SHU9119均60 nL，注射10 min后繪制PVN-aCSF/PVN-SHU9119壓力感受性反射曲線。

1.4 數(shù)據(jù)獲得及壓力感受性反射曲線生成 基礎(chǔ)SNA、平均動(dòng)脈壓(MAP)、心率(HR)應(yīng)用Biopac MP100 數(shù)據(jù)獲得和分析系統(tǒng)記錄，2 000 Hz進(jìn)行采樣。SNA經(jīng)帶通濾過和放大，數(shù)據(jù)采集后SNA信號(hào)整合成1 s內(nèi)的頻數(shù)，以%為單位。壓力感受性反射曲線是靜脈微量注射泵注射硝普鈉使血壓快速下降至50 mmHg，而后應(yīng)用鹽酸苯腎上腺素使血壓緩慢上升，3～5 min升至175 mmHg，觀察由血壓、HR變化而形成的擬合S曲線。壓力感受性反射曲線是應(yīng)用Boltzmann方程[(P1-P2)/[1+exp(MAP-P3)/P4]+P2]進(jìn)行繪制。P1是HR或SNA最大值(Max), P2是HR或SNA最小值(Min), P3是MAP在HR或SNA取中值時(shí)的血壓(BP50), P4是寬度。參數(shù)最大值、最小值和中點(diǎn)均在曲線圖中標(biāo)出，壓力感受性反射功能變化由SNA壓力反射曲線中Max、Min和BP50來反映和表示[7]。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時(shí)間SNA、MAP、HR基礎(chǔ)值比較 PVN-aCSF組中，與注射LPN 0 h相比，注射LPN 1 h后和PVN注射aCSF后的SNA、HR值均升高(P均<0.05)，且以PVN注射aCSF后的SNA、HR值最高(P均<0.05)。與注射LPN 0 h相比，注射LPN 1 h的MAP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但PVN注射aCSF后的MAP升高(P<0.05)。PVN-SHU9119組中，與注射LPN 0 h相比，注射LPN 1 h和PVN注射SHU9119后的SNA均升高(P均<0.05)，但PVN注射SHU9119后的SNA低于注射LPN 1 h后的SNA(P<0.05)。與注射LPN 0 h相比，注射LPN 1 h后HR升高(P<0.05)，PVN注射SHU9119后的HR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且PVN注射SHU9119后的HR低于注射LPN 1 h后的HR(P<0.05)。PVN注射SHU9119后的SNA、MAP及HR均低于同時(shí)期PVN-aCSF組的對(duì)應(yīng)值(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組不同時(shí)間SNA、MAP、HR基礎(chǔ)值比較

注：與注射LPN 0 h比較，*P<0.05；與注射LPN 1 h比較，△P<0.05；與PVN-aCSF組比較，#P<0.05。

2.2 兩組不同時(shí)間交感神經(jīng)壓力反射功能參數(shù)Max、Min、BP50比較 PVN-aCSF組中，與注射LPN 0 h相比，注射LPN 1 h后和PVN注射aCSF后的Max、Min均升高(P均<0.05)，且以PVN注射aCSF后的Max、Min最高(P均<0.05)，PVN注射aCSF后的BP50升高(P<0.05)。PVN-SHU9119組中，與注射LPN 0 h相比，注射LPN 1 h后和PVN注射SHU9119后的Max、Min均升高(P均<0.05)，但PVN注射SHU9119后的Max低于注射LPN 1 h后(P<0.05)。PVN注射SHU9119后的Max低于同時(shí)間PVN-aCSF組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組不同時(shí)間交感神經(jīng)壓力反射功能參數(shù)Max、Min、BP50比較

注：與注射LPN 0 h比較，*P<0.05；與注射LPN 1 h比較，△P<0.05；與PVN-aCSF組比較，#P<0.05。

2.3 兩組不同時(shí)間心率壓力反射功能參數(shù)Max、Min和BP50比較 PVN-aCSF組中，與注射LPN 0 h相比，注射LPN 1 h后和PVN注射aCSF后的Max、BP50均升高(P<0.05)。與注射LPN 0 h相比，注射LPN 1 h后的Min差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但PVN注射aCSF后的Min升高(P<0.05)。PVN-SHU9119組中，與注射LPN 0 h相比，注射LPN 1 h后和PVN注射SHU9119后的Max、Min、BP50均升高(P均<0.05)，但PVN注射SHU9119后的Max低于注射LPN 1 h后的Max(P<0.05)。PVN注射SHU9119后的Max、Min、BP50值低于同時(shí)間PVN-aCSF組(P均<0.05)。見表3。

表3 兩組不同時(shí)期心率壓力反射功能參數(shù)Max、Min、BP50比較

注：與注射LPN 0 h比較，*P<0.05；與注射LPN 1 h比較，△P<0.05；與PVN-aCSF比較，#P<0.05。

3 討論

已知高血壓常與其他心血管病危險(xiǎn)因素共存，可損傷重要臟器，如心、腦、腎的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致這些器官的功能衰竭，故了解高血壓的發(fā)病機(jī)制尤為重要。在高血壓發(fā)生的不同階段,均發(fā)現(xiàn)交感神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮,且高血壓患者的交感神經(jīng)興奮程度與血壓增加絕對(duì)值呈正相關(guān)，同時(shí)壓力反射敏感性明顯降低，壓力感受器受損，對(duì)生理刺激的反應(yīng)性下降。LPN作為一種由脂肪細(xì)胞合成和分泌的蛋白質(zhì)類激素，是內(nèi)分泌系統(tǒng)中影響肥胖的一個(gè)重要因子。LPN不僅通過中樞系統(tǒng)抑制食欲、增加能量消耗以調(diào)節(jié)能量平衡，而且能通過各種方式參與高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等疾病的發(fā)生。已有研究表明注射LPN可以使大鼠血壓和HR上升，但具體機(jī)制不清。有研究表明，LPN可以通過作用于下丘腦，刺激MSH表達(dá)，同時(shí)上調(diào)PVN及孤束核區(qū)域的MC4R水平。本研究目的是探討MC4R是否參與了LPN調(diào)控交感神經(jīng)活性及壓力感受性反射功能，并觀察其參數(shù)的變化趨勢(shì)。

LPN是由ob基因(位于人染色體7q32)編碼的一種由167個(gè)氨基酸組成的分泌型蛋白質(zhì)類激素。Simonds等[8]發(fā)現(xiàn)，LPN可以增加嚙齒動(dòng)物和人類的交感神經(jīng)活動(dòng)，且僅僅對(duì)嚙齒動(dòng)物的血壓有長(zhǎng)期持續(xù)增加的效果，它增加嚙齒類動(dòng)物血壓的能力是通過下丘腦和額外的下丘腦區(qū)域調(diào)節(jié)。有研究表明，靜脈注射LPN降低了內(nèi)臟血流量，這有助于其升壓作用[9],選擇性顯微注射LPN到下丘腦細(xì)胞核及孤束核后,可明顯增加SNA。MC4R屬于含7個(gè)跨膜區(qū)的G蛋白耦聯(lián)受體，是中樞黑皮素旁路的重要組成部分。MC4R廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，位于下丘腦核、PVN、背內(nèi)側(cè)核及下丘腦后部等,可控制能量平衡、葡萄糖穩(wěn)態(tài)及交感輸出。MC4R活化必須與配體相結(jié)合，α-MSH是MC4R主要的激活型配體，α-MSH與MC4R結(jié)合可以激活MC4R的活性。PVN是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的整合區(qū)域，是直接調(diào)控交感神經(jīng)傳出活動(dòng)最主要的中樞位點(diǎn)。LPN調(diào)節(jié)的可能機(jī)制是激活下丘腦弓狀核和PVN神經(jīng)元上的LPN受體,通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)下行通路,從而調(diào)節(jié)糖代謝及增強(qiáng)SNA等。本研究通過繪制各時(shí)間壓力感受性反射曲線，觀察到PVN-aCSF組中，與0 h LPN相比，注射1 h LPN后和PVN注射aCSF后的SNA、HR均升高，且以PVN注射aCSF后的SNA、HR最高，說明LPN的持續(xù)作用增強(qiáng)了SNA，升高HR。在PVN-SHU9119組中，PVN注射SHU9119后的SNA、HR低于注射LPN 1 h后SNA、HR，同時(shí)均低于同時(shí)期PVN-aCSF組的對(duì)應(yīng)值，說明MC4R可能是LPN激活交感神經(jīng)系統(tǒng)的介質(zhì)因子，并且了解到LPN影響SNA可能是通過PVN整合信號(hào)。我們發(fā)現(xiàn)PVN-SHU9119組中注射SHU9119后的SNA較注射LPN 1 h時(shí)降低，但較注射LPN 0 h時(shí)仍升高，說明MC4R抑制劑SHU9119可能部分參與了調(diào)控LPN影響交感神經(jīng)的機(jī)制中。我們推測(cè)PVN-MC4R是LPN增強(qiáng)交感神經(jīng)活性的一部分途徑。

壓力感受性反射功能對(duì)維持正常交感輸出具有關(guān)鍵作用，反射功能低下可導(dǎo)致交感活動(dòng)反射性抑制功能缺乏，從而導(dǎo)致交感輸出的增加，即外周交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)，因此我們推測(cè)LPN影響交感神經(jīng)活動(dòng)的興奮，使得壓力感受性反射功能異常。本研究對(duì)LPN影響交感神經(jīng)和HR的壓力感受性反射功能做了較全面的分析，結(jié)果表明在持續(xù)側(cè)腦室注射LPN的前提下，PVN注射aCSF后，交感神經(jīng)和心率壓力反射曲線中Max、BP50均升高，交感神經(jīng)壓力反射曲線中PVN注射SHU9119后的Max低于同時(shí)間PVN-aCSF組的對(duì)應(yīng)值，而心率壓力反射曲線顯示PVN注射SHU9119后的Max、Min、BP50均低于同時(shí)間PVN-aCSF組，進(jìn)一步證實(shí)MC4R參與了LPN調(diào)控壓力反射性感受功能。

綜上所述，LPN增加SNA、引起壓力感受性反射功能變化，可能是由于整合中樞PVN的MC4R部分參與，但是否有其他神經(jīng)內(nèi)分泌因子參與其中仍需進(jìn)一步研究。該研究揭開了LPN及MC4R對(duì)大腦交感神經(jīng)活性及壓力感受性反射功能的關(guān)系，有助于進(jìn)一步更好地理解MC4R在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)高血壓、心血管功能的作用機(jī)制，并可能對(duì)治療心血管及內(nèi)分泌疾病提供了新的治療策略。