IL-10啟動子基因多態(tài)性與腦梗死相關(guān)性分析

袁 磊，杜敢琴

腦梗死是個體長期功能障礙的主要原因之一，降低患者的獨立性和生活質(zhì)量。非特異性炎癥在缺血/再灌注損傷中的作用已經(jīng)得到闡明，并且既往研究已經(jīng)證明其在腦梗死急性期發(fā)揮關(guān)鍵作用[1-2]。腦缺血誘導(dǎo)強烈的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，其特征在于活化的細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和加劇組織損傷的蛋白水解酶等。白介素-10(interleukin-10，IL-10)是一種多效性細(xì)胞因子，可在腦缺血損傷過程中發(fā)揮抗炎作用[1]。IL-10基因啟動子高度多態(tài)，具有多個單核苷酸多態(tài)性位點。最重要的3個位點是-1082A/G、-819C/T和-592C/A。白介素-10(IL-10)缺乏會加劇炎癥并惡化腦缺血。鑒于IL-10基因啟動子區(qū)域中單核苷酸多態(tài)性位點-1082A/G和-819C/T的作用，本研究重點關(guān)注IL-10基因啟動子多態(tài)性與腦梗死之間的關(guān)系，采用擴(kuò)增突變系統(tǒng)—聚合酶鏈反應(yīng)(ARMS-PCR)檢測腦梗死患者-1082A/G和-819C/T的分布頻率[2]，研究結(jié)果支持IL-10 A等位基因決定了腦梗死遺傳易感性的觀點，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2016年7月至2017年7月河南省南陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的急性腦梗死患者154例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～80歲；②發(fā)病24 h內(nèi)就診；③符合《中國急性缺血腦卒中診治指南2015》中急性腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；④病因經(jīng)頭顱MRA或CTA證實為動脈粥樣硬化。對照組126例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～80歲；②既往無腦梗死病史；③無腦梗死臨床表現(xiàn)，查體無腦梗死體征；④頭顱CT或MRI排除腦梗死。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：①短暫性腦缺血發(fā)作；②伴心肌梗死、血管炎、創(chuàng)傷、甲狀腺疾病、血液疾病、使用免疫抑制劑、癌癥、妊娠、自身免疫性疾病、感染、腦血管畸形或動脈瘤[4]；③伴有意識障礙者。該研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法收集兩組人口學(xué)特征(性別、年齡)、腦梗死高危因素(高血壓、糖尿病、冠心病、心房纖顫等病史)，并對兩組分別利用擴(kuò)增突變系統(tǒng)—聚合酶鏈反應(yīng)方法進(jìn)行等位基因多態(tài)性分型，見表1。

表1 IL-10-1082A/G和-819C/T基因座位引物

1.3基因組DNA的提取將兩組空腹肘靜脈血樣品置于EDTA-Na抗凝管中。根據(jù)DNA提取試劑盒(Promega Corporation，Madison，WI，USA)的說明進(jìn)行基因組DNA提取。 DNA工作溶液的最終濃度為0.1 g·L-1，工作溶液儲存在-20 ℃。

1.4IL-10啟動子多態(tài)性檢測基因測試引物由上海生物工程技術(shù)公司(中國上海)合成。根據(jù)先前描述的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增(MBI Fermentas，上海)。 IL-10-1082A/G和-819C/T基因座位引物見表1?；蚨鄳B(tài)性通過ARMS 進(jìn)行基因分型。每25 μL工作溶液中含有25～50 ng基因組DNA，0.25 mM特異性引物和0.1 mM內(nèi)部對照引物，1.5 mM MgCl2，0.2 mM每種dNTP，500 mM KCl，200 mM Tris-HCl，0.001%明膠和0.5 U Taq DNA聚合酶。內(nèi)部參考引物用于鑒定成功的PCR擴(kuò)增，并擴(kuò)增HLA-DRB1基因的外顯子3的保守區(qū)域。擴(kuò)增IL-10-1082G/A和-819C/T等位基因的ARMS-PCR：95 ℃下1 min變性進(jìn)行擴(kuò)增，然后95 ℃下10個循環(huán)15 s，65 ℃ 50 s，72 ℃ 40 s，以及95 ℃ 20 s，59 ℃ 50 s和72 ℃ 30 s的20個循環(huán)，然后冷卻至4 ℃。PCR擴(kuò)增后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。天源測序生物技術(shù)有限公司(中國北京)對兩組基因譜帶進(jìn)行測序。258 bp處的電泳帶代表純合子等位基因，即G(GG)或A(AA)。 使用相同的兩對引物，另一個258 bp的電泳帶代表雜合子等位基因(AG)，見圖1。

圖1 基因分型電泳圖譜為白介素(IL)-10啟動子區(qū)-1082位點

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，等位基因頻率計算為：(2×純合子+雜合子)/(2×患者數(shù))。使用Hardy-Weinberg平衡法分

析每組的代表性樣品。分類數(shù)據(jù)[n(%)]通過卡方檢驗進(jìn)行分析。以正態(tài)分布為特征的測量數(shù)據(jù)(平均值±SD)通過雙樣本t檢驗分析。采用多變量logistic回歸分析法篩選腦梗死的高危因素，并計算優(yōu)勢比(odds ratio,OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1單因素分析觀察組和對照組性別、年齡及高血壓、冠心病、糖尿病、腦卒中病史、心房顫動發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2；觀察組高同型半胱氨酸、顱內(nèi)動脈狹窄高于對照組，兩組IL-10-1082A/G基因型分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對于IL-10-1082位點，觀察組A等位基因頻率92.21%顯著高于對照組的85.32%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 兩組臨床基線資料比較

注：①與對照組比較，P<0.05。

表3 兩組白介素-10-1082A/G和-819C/T等位基因頻率比較 例(%)

注：①與對照組比較，P<0.05。

2.2多因素分析將單變量分析中有統(tǒng)計學(xué)差異的變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析，高同型半胱氨酸(有=1，無=0)、將空腹血糖(實測值)、顱內(nèi)動脈狹窄(有=1，無=0)、入院后血壓降低(有=1，無=0)、IL10-1082位點A基因型(有=1，無=0)作為自變量，以急性腦梗死(有=1，無=0)為因變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果表明，IL10-1082位點AA基因型、高同型半胱氨酸是急性腦梗死發(fā)生的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 腦梗死高危因素的多因素logistic回歸分析

3 討論

缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的，由促炎細(xì)胞因子和趨化因子以及其他炎性介質(zhì)介導(dǎo)的非特異性炎癥在其中發(fā)揮重要作用[5]。IL-10可以防止缺血腦組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)，并且通過激活素依賴機(jī)制限制對腦的興奮毒性損傷[6]。IL-10的保護(hù)機(jī)制是通過下調(diào)IL-1β、腫瘤壞死因子α、P-選擇素和其他促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的[7]。研究顯示P-選擇素、IL-6啟動子多態(tài)性和腦梗死之間有密切關(guān)聯(lián)[8]。這些發(fā)現(xiàn)表明IL-10有助于減少局灶性腦缺血后的梗死體積和促進(jìn)神經(jīng)改善。

IL-10基因啟動子區(qū)大約5 kb，位于翻譯起始位點上游。IL-10基因啟動子高度多態(tài)，具有多個單核苷酸多態(tài)性位點[9]。最重要的3個是IL-10-1082A/G、IL-10-819C/T和IL-10-592C/A。本研究發(fā)現(xiàn)中國漢族人群中IL-10-1082位點G等位基因攜帶者的頻率顯著低于愛爾蘭、墨西哥和其他種族。此外，本數(shù)據(jù)顯示IL-10-1082基因座GG基因型在中國漢族群體中是不可檢測的，并且僅存在AA和/或AG基因型。這些發(fā)現(xiàn)表明，某些炎性細(xì)胞因子的基因多態(tài)性根據(jù)種族而不同[10]。以上研究證明單核苷酸多態(tài)性位點IL-10-819和IL-10-592處的遺傳連鎖是相關(guān)的[11]。研究表明IL-10基因多態(tài)性與漢族人群血清脂蛋白水平之間的關(guān)系。與AA基因型相比，IL-10-1082GA基因型攜帶者的HDL濃度較高，TG水平較低。既往研究表明，IL-10啟動子區(qū)-1082位的多態(tài)性可能影響血清HDL和TG濃度，而該基因的其他突變體似乎與血清脂蛋白水平無關(guān)[12]。

IL-10基因啟動子多態(tài)性與體內(nèi)IL-10表達(dá)水平密切相關(guān)。研究表明，與IL-10-1082A、-819T和-592A相比，IL-10-1082G、-819C和-592C是高度表達(dá)的等位基因。在等位基因IL-10-1082A存在時，用刀豆蛋白A刺激淋巴細(xì)胞導(dǎo)致比等位基因-1082A陰性細(xì)胞更低的IL-10產(chǎn)生[13]。研究還發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)量不依賴于等位基因IL-10-819和-592，表明IL-10水平主要由-1082基因型決定。本研究提示AA基因型腦梗死風(fēng)險比AG基因型高2倍(OR=2.031,95%CI：1.134～3.637)。因此，AA基因型是腦梗死的獨立危險因素。本研究結(jié)果顯示腦梗死患者中A等位基因頻率(92.2%)高于正常對照組(85.7%)。這在IL-10-819C/T和-592C/A基因型分布和等位基因頻率中沒有[14]，表明腦梗死的發(fā)病率與IL-10-1082A/G等位基因密切相關(guān)[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)IL-10-1082基因多態(tài)性與腦梗死顯著相關(guān)，腦梗死易感基因的檢測有利于鑒別疾病風(fēng)險人群，提高療效。