雙脫甲氧基姜黃素對db/db小鼠胰島素抵抗和糖穩(wěn)態(tài)作用及機(jī)制研究

胡淑芳 楊麗 徐子輝

1武漢市漢口醫(yī)院內(nèi)分泌科（武漢 430012）；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，分子診斷湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢 430014）

2型糖尿?。╰ype II diabetes，T2D）是以胰島素抵抗和胰腺細(xì)胞功能喪失引起的糖脂代謝紊亂為重要病理特征的威脅人類健康的慢性代謝疾病［1］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2013年全球約有3.82億人口患有糖尿病，且以9.5%的增長率逐年遞增，至2035年或可能達(dá)到5.92億［8］。同時(shí)，占據(jù)90%糖尿病總數(shù)的2型糖尿病引起腎臟衰竭、肝損傷和神經(jīng)元凋亡等多種嚴(yán)重疾病。研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，肝臟、肌肉和脂肪等主要糖脂代謝組織的胰島素敏感性降低和胰島炎癥細(xì)胞浸潤是T2D血糖不受控制的主要因素。并且，目前臨床針對T2D的治療方式以羅格列酮（rosiglitazone，RG）等促胰島素分泌和胰島素增敏劑為主，然而，此類治療方式易致低血糖和體重增加，并且餐后血糖難以控制［4］。因此，替代療法和消渴藥等天然化合物的對于2型糖尿病的治療作用備受關(guān)注［5］。

雙脫甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcumin，BDMC）是從傳統(tǒng)中藥姜黃（curcuma longa L）根莖中提取具有抗腫瘤、降脂等作用的天然化合物單體［6］。研究［7］證實(shí)，BDMC可以通過清除自由基和增強(qiáng)抗炎作用、激活過氧化物酶體增生物激活受 體-γ（peroxisome prolifterator?activated receptor gamma，PPAR?γ）等具有預(yù)防和改善T2D的作用。而AMPK信號(hào)通路以及G6Pase和PEPCK是機(jī)體調(diào)控糖自穩(wěn)的重要信號(hào)分子，并且最新研究發(fā)現(xiàn)雙脫甲氧基姜黃素具有調(diào)控AMPK信號(hào)通路作用。然而，BDMC對胰島素抵抗和糖自穩(wěn)等的作用目前尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)主要觀察BDMC治療后db/db糖尿病小鼠胰島素抵抗和糖自穩(wěn)的情況，為雙脫甲氧基姜黃素在T2D的臨床治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑雙脫甲氧基姜黃素和羅格列酮購置于美國Sigma公司，血糖儀使用美國Johnson公司One Touch Ultra，穩(wěn)豪型血糖儀。小鼠血漿胰島素ELISA檢測試劑盒（Millipore，Billerica，MA，USA）。pAMPK，AMPK，pAS160（Thr172），AS160，PM?GLUT4，GLUT4，G6Pase，和PEPCK多克隆抗體購自于美國Abcam公司，β?actin單克隆抗體購自于武漢康為世紀(jì)公司，二抗購自于武漢Abclone公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組本實(shí)驗(yàn)采用的db/db糖尿病小鼠購置于北京華阜康生物科技股份有限公司，并于武漢市漢口醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以C57BL/6為對照組（WT），選用4周齡的雄性db/db小鼠，體質(zhì)量21～23 g之間，依照體重，均衡隨機(jī)分3組，每組9只。db/db組以生理鹽水灌胃，RG治療組以RG 0.5 mg/（kg·d），BDMC治療組以BDMC 15 mg/（kg·d）灌胃至6周。實(shí)驗(yàn)期間，自由飲食、飲水，于每周檢測各組小鼠的隨機(jī)血糖。第6周末置于代謝籠中監(jiān)測其呼吸交換率和能量輸出變化，行口服糖耐量試驗(yàn)（OGTT）。

1.3OGTT于第6周末將各組小鼠隔夜禁食12 h，依據(jù)體質(zhì)量以0.5 g/kg給予葡萄糖灌胃口服，分別于0、30、60、90和120 min血糖及血漿胰島素水平。

1.4外周血HbA1c檢測采集空腹抗凝血，分離血清，采用酶法檢測各組小鼠外周血糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）含量，檢測儀器為BIO?RAD D10TM檢測儀。

1.5外周血血脂含量檢測采用酶法檢測各組小鼠血漿中TC、TG、HDL?C、LDL?C和FFA含量。

1.6 HOMA?IR和QUICKI評估胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)指數(shù)（homeostatic index of insulin resistance，HOMA?IR）通過穩(wěn)態(tài)模型評價(jià)，計(jì)算公式為：HOMA?IR=（空腹血糖值×空腹血胰島素值）/22.51。定量胰島素敏感性檢測指數(shù)分析（quantita?tive insulin sensitivity check index，QUICKI）通過公式計(jì)算：QUICKI=1÷［Log（空腹血胰島素值）+Log（空腹血糖值）］。

1.7Western blot檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，取出肝臟和骨骼肌肉組織、以PBS洗去血漬，稱取100 mg加入200 μL含cocktail和磷酸化酶抑制劑的RIPA裂解液，冰水浴剪碎后超聲破碎，冷卻并冰上裂解10 min，12 000 g離心20 min取上清至新Ep管中，采用考馬斯亮藍(lán)G250法檢測濃度后，取出200 μL并調(diào)節(jié)蛋白濃度至5 μg/L。隨即，檢測肝臟G6Pase、PEPCK和骨骼肌p?AMPK、AMPK、PM?GLUT4、GLUT4、pAS160、AS160蛋白表達(dá)水平。加入含BE的5×loading buffer并95℃干熱變性10 min，冰上冷卻后以100 μg總蛋白，10%SDS?PAGE分離膠電泳分離，200 mA恒流濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA的TBST溶液室溫封閉1 h，加入一抗后4℃搖床孵育8 h，第二天TBST室溫漂洗四次，每次5 min。孵育二抗TBST溶液（以1∶10 000稀釋）室溫2 h，TBST室溫漂洗4次，每次5 min。ECL發(fā)光顯示。蛋白表達(dá)以灰度值表示，標(biāo)準(zhǔn)化至β?actin灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，組建比較采用student′t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α為0.05。統(tǒng)計(jì)圖均采用Prism 5.0作圖。

2 結(jié)果

2.1BDMC抑制db/db小鼠體質(zhì)量增加和飲食增多結(jié)果如表1所示，db/db組小鼠體質(zhì)量逐漸增加，在第3、6周明顯高于WT組（P＜0.05），且食物、水分?jǐn)z入量明顯高于WT組。經(jīng)BDMC和RG處理的第6周，兩組小鼠體重、食物和飲水?dāng)z入量均明顯低于db/db組（P＜0.05）。

2.2BDMC抑制db/db小鼠呼吸和代謝減慢結(jié)果如圖1所示，db/db組小鼠全天呼吸交換比率、夜間能量消耗量明顯低于WT組（P＜0.05），而白天能量消耗量沒有明顯的變化（圖1B，P＞0.05），db/db組小鼠整體呼吸交換比率和能量消耗量明顯低于WT組（P＜0.05）。經(jīng)BDMC處理后，小鼠呼吸交換比率和能量消耗量均明顯高于db/db組（P＜0.05）。

表1 BDMC對db/db小鼠食物、水分?jǐn)z入量和體質(zhì)量影響Tab.1 Effect of BDMC on food and water intake，and body weights of db/db mice±s

表1 BDMC對db/db小鼠食物、水分?jǐn)z入量和體質(zhì)量影響Tab.1 Effect of BDMC on food and water intake，and body weights of db/db mice±s

注：與WT組相比較，*P＜0.05；與db/db組相比較，#P＜0.05

食物攝入量（g/天）飲水?dāng)z入量（g/天）體重（g）Week 0 Week 3 Week 6 WT 2.29±0.18 3.75±0.33 21.93±0.45 25.23±1.13 32.97±0.94 db/db 4.32±0.47*5.57±0.61*22.29±0.76 29.83±1.29*40.18±2.21*db/db?RG 3.18±0.84#4.86±0.82#22.86±0.86 28.53±2.03 36.75±2.39#db/db?BDMC 3.11±0.79#4.12±0.98#23.37±0.56 28.25±1.84 37.04±2.40#

圖1 BDMC對db/db小鼠呼吸交換比率和能量消耗量的影響Fig.1 Effect of BDMC on respiratory exchange rate and energy expenditure of db/db mice

2.3BDMC抑制db/db小鼠胰島素抵抗結(jié)果如圖2和表2所示，db/db小鼠空腹血糖量在實(shí)驗(yàn)期間逐漸增加，于第3周至6周，與外周血HbA1c、胰島素含量、HOMA?IR和QUICKI均明顯高于WT組（P＜0.05），經(jīng)RG處理6周時(shí)，空腹血糖量、外周血HbA1c、胰島素含量和HOMA?IR明顯低于db/db組（P＜0.05），QUICKI沒有明顯的變化（P＞0.05）。BDMC處理后，小鼠空腹血糖量、胰島素和HOMA?IR含量明顯低于db/db組，HbA1c含量和QUICKI沒有明顯的變化（P＞0.05）。

2.4BDMC抑制db/db小鼠糖耐受實(shí)驗(yàn)各組小鼠在6周后灌胃口服葡萄糖，檢測各時(shí)間點(diǎn)血糖。結(jié)果如圖3所示，db/db小鼠血糖逐漸降低，但下降速度明顯低于WT組小鼠（P＜0.05）。BDMC組小鼠血糖下降速度明顯高于db/db小鼠（P＜0.05）。

2.5BDMC抑制db/db小鼠血脂升高結(jié)果如表3所示，db/db小鼠血TG、TC、FFA、LDL?C和HDL?C明顯高于WT組小鼠（P＜0.05）。BDMC和RG組小鼠血TG、TC、FFA、LDL?C 和HDL?C 明顯低于db/db小鼠（P＜0.05）。

圖2 服用BDMC的db/db小鼠空腹血糖和血糖化血紅蛋白的變化Fig.2 Changes in fasting blood glucose concentrations and blood glycosylated hemoglobin in db/db mice administered BDMC

表2 BDMC對db/db小鼠胰島素抵抗標(biāo)志的影響Tab.2 Effect of BDMC on markers of Insulin resistance in db/db mice ±s

表2 BDMC對db/db小鼠胰島素抵抗標(biāo)志的影響Tab.2 Effect of BDMC on markers of Insulin resistance in db/db mice ±s

注：與WT組相比較，*P＜0.05；與db/db組相比較，#P＜0.05

Plasma insulin（ng/mL）HOMA?IR QUICKI WT 2.21±0.15 14.53±2.43 0.19±0.03 db/db 4.54±0.28*89.04±10.34*0.26±0.04*db/db?RG 3.14±0.45#34.48±8.03#0.24±0.05 db/db?BDMC 2.74±0.73#55.92±9.38#&0.23±0.07

圖3 BDMC對db/db小鼠口服糖耐量實(shí)驗(yàn)的影響Fig.3 The effect of BDMC on oral glucose tolerance test in db/db mice

表3 BDMC對db/db小鼠血脂的影響Tab.3 Effect of BDMC on plasma lipid concentrations in db/db mice ±s

表3 BDMC對db/db小鼠血脂的影響Tab.3 Effect of BDMC on plasma lipid concentrations in db/db mice ±s

注：與WT組相比較，*P＜0.05；與db/db組相比較，#P＜0.05

TC（mmol/L）TG（mmol/L）FFA（mmol/L）HDL?C（mmol/L）LDL?C（mmol/L）WT 1.83±0.12 0.75±0.06 0.43±0.03 0.93±0.15 0.69±0.15 db/db 4.64±0.34*2.45±0.08*1.31±0.12*2.54±0.23*1.12±0.24*db/db?RG 2.35±0.61#1.38±0.14#0.78±0.23#1.39±0.42#0.86±0.35#db/db?BDMC 3.54±0.65#1.71±0.32#0.96±0.27#1.75±0.43#0.92±0.64#

2.6 BDMC抑制db/db小鼠肝臟糖再生和促進(jìn)糖代謝G6Pase和PEPCK是肝臟中調(diào)節(jié)糖再生和糖代謝的重要生物酶，因此檢測肝臟中表達(dá)量。結(jié)果如圖4所示，db/db小鼠肝臟G6Pase和PEPCK蛋白表達(dá)量明顯高于WT小鼠（P＜0.05），經(jīng)BDMC處理后，小鼠G6Pase和PEPCK蛋白含量明顯低于db/db小鼠（P＜0.05）。

圖4 BDMC對db/db小鼠糖再生和糖代謝的影響。Fig.4 The effect of BDMC on gluconeogenesis and glucose metabolism in db/db mice

2.7 BDMC抑制db/db小鼠骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)AMPK信號(hào)通路調(diào)控骨骼肌中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)而影響葡萄糖自穩(wěn)，因此檢測骨骼肌中相關(guān)蛋白。結(jié)果如圖5所示，db/db小鼠骨骼肌中pAMPK、PM?GLUT4和pAS160蛋白表達(dá)量明顯低于WT小鼠（P＜0.05），經(jīng)BDMC和RG處理后，小鼠pAMPK、PM?GLUT4和pAS160蛋白含量明顯高于db/db小鼠（P＜0.05）。

圖5 BDMC對db/db小鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Fig.5 The effect of BDMC on glucose transportation of db/db mice

3 討論

2型糖尿?。═2D）及其并發(fā)癥是現(xiàn)代社會(huì)中的重要健康問題，發(fā)病率逐年升高，且現(xiàn)用于臨床治療T2D的藥物存在易致低血糖、耐受性等問題，同時(shí)糖尿病患者餐后血糖控制是防止糖尿病的重要環(huán)節(jié)［8］。因此，新型抗糖尿病藥物的研發(fā)迫在眉睫。

BDMC是具有降血脂、抗炎作用的中藥姜黃有效成分之一，具有抑制胰腺α-淀粉酶和調(diào)控PPAR?γ的作用而產(chǎn)生抗T2D效應(yīng)［7，9］。文獻(xiàn)報(bào)道稱其抗糖尿病作用比姜黃的姜黃素和去甲氧基姜黃素作用強(qiáng)［10］。同時(shí)，BDMC調(diào)控MAPK和NF?κB信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)［11］，且其抗氧化作用對胰腺細(xì)胞有保護(hù)作用，抑制胰島、肝臟、脂肪等慢性低度炎癥反應(yīng)［12］。因此，BDMC具有更好的抗T2D研究和治療價(jià)值。然而，關(guān)于BDMC對T2D的效應(yīng)機(jī)制研究尚不明確。

在本研究中，口服BDMC對leptin受體缺陷的T2D型db/db小鼠產(chǎn)生的胰島素抵抗和糖穩(wěn)態(tài)失衡產(chǎn)生明顯的改善作用。其與PPAR?γ激動(dòng)劑RG相比，對T2D型db/db小鼠多食、多飲和體重增加影響更為顯著，對血脂的影響低于RG，提示，BD?MC抗T2D的機(jī)制不僅僅作用于PPAR?γ。因此，本研究分析其糖再生和糖代謝過程。通過檢測發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠在BDMC處理后，比RG處理的肝臟G6Pase和PEPCK顯著降低，引起糖生成減少，血糖降低更為明顯。而在骨骼肌糖轉(zhuǎn)運(yùn)研究中，BDMC和RG對db/db小鼠骨骼肌受抑制的AMPK?AS160?GLUT4信號(hào)通路的具有相似的上調(diào)作用［13］。因此，BDMC具有更好的抗T2D的效應(yīng)，且該作用與減少肝臟糖再生和加速糖代謝有關(guān)。

綜上所述，BDMC可明顯改善db/db小鼠胰島素抵抗和糖脂代謝減慢，減輕肝臟糖再生和加速糖代謝，并具有加快骨骼肌糖攝取而具有拮抗治療T2D的潛在應(yīng)用價(jià)值，且比RG具有更好的控制血糖的作用。

本研究首次發(fā)現(xiàn)BDMC可通過除PPAR?γ之外的 AMPK?AS160?GLUT4信號(hào)通路和 G6Pase和PEPCK調(diào)控2型糖尿病，具有相當(dāng)?shù)脑隗w抑制糖再生和加速糖代謝，以及降低胰島素抵抗的作用，并且優(yōu)于羅格列酮。然而，BDMC為何對HbA1c等沒有明顯的作用，仍有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，而本研究為BDMC在T2D的臨床治療方面的開發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持，其可能成為新的抗T2D的新型藥物，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。然而，BDMC對T2D保護(hù)作用的其他機(jī)制仍然有待研究，且T2D病人常存在遺傳性改變和飲食類別差異等多樣影響因素，因此BDMC的抗T2D機(jī)制仍需要更多的探究。