龍竹微波水熱法制備低聚木糖的研究

王 毓，熊子靈，肖 霄，李居南

(1.新希望乳業(yè)股份有限公司 產(chǎn)品研發(fā)中心，成都 610041; 2.成都市華測檢測技術(shù)有限公司 食藥農(nóng)化事業(yè)部， 成都 610041; 3.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，成都 610065； 4.蒙牛集團(tuán) 研發(fā)創(chuàng)新部，北京 101100)

隨著人類對健康的日益重視，低聚木糖作為一種十分有潛力的益生元，目前受到廣泛關(guān)注。低聚木糖是一類以木糖為基本單元、聚合度為2～10的寡糖。目前，大量研究證明低聚木糖對人體腸道益生菌的生長有良好的促進(jìn)作用[1]。

低聚木糖在天然產(chǎn)物中的含量很低，難以提取。而農(nóng)林生物質(zhì)中的半纖維素組分含有大量木聚糖，是制備低聚木糖的良好原料。目前，有大量文獻(xiàn)報道可采用玉米芯、蔗渣、楊木、小麥秸稈等為原料來制備低聚木糖[2-3]。而所用的方法主要有3種：酸水解法、酶水解法以及自水解法，其中自水解法因其不需要化學(xué)試劑的特性，以及水解后的物料可用做制備生物乙醇的原料的特性，有較多研究報道和應(yīng)用[4]。自水解法也稱水熱處理法，它是通過水在高溫高壓下釋放出的水合氫離子來促進(jìn)生物質(zhì)的水解。通過控制反應(yīng)溫度等條件，以達(dá)到較好的制備低聚木糖的效果。與此同時，也有相關(guān)研究報道表明，水熱法制備的低聚木糖對人體腸道益生菌的體外發(fā)酵效果較酶水解低聚木糖更好[5-6]。因此，工業(yè)上越來越多地采用水熱法來制備低聚木糖。微波處理是一種良好的促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)的方法，在化學(xué)合成、降解等方面有較多應(yīng)用。微波輔助法可以加速化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行，且其升溫速率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)加熱方法，因此微波輔助水熱處理可以加速生物質(zhì)的水解，制備低聚木糖[7]。

龍竹作為一種廣泛分布于中國云南地區(qū)的竹材，其產(chǎn)量巨大、生長迅速、成本低廉、工業(yè)利用潛力大。本研究采用微波輔助水熱法、以龍竹為原料來制備低聚木糖，通過對反應(yīng)溫度進(jìn)行控制以獲取最佳反應(yīng)條件，并與傳統(tǒng)水熱法進(jìn)行對比。

1 材料與方法

1.1 原 料

龍竹原料于2015年采集自云南省，經(jīng)80 ℃烘干后粉碎、過篩取其中40～80目的樣品。分離后的竹粉樣品置于索氏提取器中抽提6 h (甲苯/乙醇，體積比為2∶1)。抽提后的樣品置于60 ℃烘箱中干燥6 h后，然后用80 ℃熱水抽提樣品4 h 以脫除所含淀粉。抽提結(jié)束后，樣品經(jīng)過濾后于60 ℃烘箱中干燥12 h，然后儲存，備用。試驗(yàn)所用甲苯、乙醇等試劑均為分析純，來自北京化工廠。

1.2 方 法

1.2.1 微波水熱處理 3.0 g竹粉與去離子水在反應(yīng)釜中混合(固液質(zhì)量比為1∶10)后放入微波反應(yīng)器進(jìn)行水熱反應(yīng)。反應(yīng)采用磁力攪拌，溫度分別控制在160、170、180、190和200 ℃，反應(yīng)時間為45 min，升溫時間為2 min，微波加熱功率為800 W，保溫功率為400 W。反應(yīng)結(jié)束后風(fēng)冷以冷卻至室溫，然后對水熱處理樣品進(jìn)行過濾，保留濾液。

1.2.2 水熱處理 同樣選取3.0 g竹粉以相同的固液質(zhì)量比(1∶10)與去離子水在含PID溫度控制器的316 L鋼制批式反應(yīng)器中混合。反應(yīng)采用磁力攪拌，溫度和時間控制在與微波輔助水熱法相同的條件下來進(jìn)行對比。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)釜用自來水冷卻，處理后的樣品過濾并保留濾液。

1.2.3 糖分析 所制備的富含低聚木糖的液體經(jīng)過0.22 μm針式過濾器過濾，然后采用配有AS50自動進(jìn)樣器和ED50檢測器的離子色譜儀(HPAEC，ICS-3000，Dionex，美國)分析糖分。其中單糖采用Carbopac PA-20(4 mm×250 mm，Dionex，美國)色譜柱進(jìn)行分析，而低聚糖則采用Carbopac PA-100(4 mm×250 mm，Dionex， 美國)色譜柱進(jìn)行分析，所采用的檢測方法參照文獻(xiàn)[8]。L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖等單糖標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich，木二糖至木六糖等5種低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)品購自Megazyme(愛爾蘭)。本研究所分析的低聚木糖得率僅針對木二糖至木六糖這5種，其他的聚合度大于6的低聚木糖因?yàn)闆]有標(biāo)準(zhǔn)品無法定量，因此不在本研究分析考察范圍[8-9]。

1.2.4 降解產(chǎn)物和分子量分析 水解制備的液體樣品經(jīng)0.22 μm針式過濾器過濾后采用配有HPX-87H (7.8 mm×300 mm,Bio-Rad Laboratories,美國)色譜柱的高效液相色譜儀(GPC,Agilent 1200,Agilent Technologies,美國)分析檢測所含的糖降解產(chǎn)物，流動相為5 mmol/L H2SO4，速率為0.6 mL/min。

樣品的分子量分析通過裝備有PLaquagel-OH 50凝膠色譜柱的 (7.7×300 mm，Polymer Laboratories Ltd.，美國)的凝膠色譜儀(GPC,Agilent 1200,Agilent Technologies,美國)進(jìn)行檢測，具體方法參見文獻(xiàn)[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚木糖的制備

原料的具體成分參見文獻(xiàn)[4]，其中半纖維素(木聚糖)含量為21.6%，包含阿拉伯糖(0.8%)、半乳糖(0.2%)、甘露糖(0.1%)、葡萄糖醛酸(0.1%)、乙?；?2.2%)和木糖(18.2%)[4]。

微波輔助法和水熱法降解龍竹粉制備低聚木糖在160、170、180、190和200 ℃下分別反應(yīng)45 min，所得的低聚木糖的產(chǎn)率如圖1所示。從圖1不難發(fā)現(xiàn)，不論是微波輔助法還是傳統(tǒng)的水熱法，它們均在反應(yīng)溫度為180 ℃時獲得最高得率，這與之前文獻(xiàn)報道結(jié)果相似[8,10]。此時，微波輔助法的低聚木糖得率為31.4%，而水熱法的得率為27.8%，由此可見在最佳反應(yīng)條件下微波輔助法有更好的效果。這樣的結(jié)果可能是由于微波加熱的特性而導(dǎo)致的，其原理是極性分子在高頻電磁場作用下極性取向改變，引起分子的熱運(yùn)動和分子間相互作用，將微波場的場能轉(zhuǎn)化為熱能[11]。因此微波加熱的升溫速率和加熱效果較傳統(tǒng)加熱方法優(yōu)勢明顯，在處理生物質(zhì)原料時可以深入原料內(nèi)部加熱，使溫度瞬時升高，從而導(dǎo)致原料結(jié)構(gòu)快速裂解。圖2為微波處理和水熱處理的升溫曲線，不難發(fā)現(xiàn)微波加熱到設(shè)定的溫度僅需2 min，而普通水熱法加熱到設(shè)定的反應(yīng)溫度需要長達(dá)40 min的加熱期。同時，由于微波加熱可以深入反應(yīng)物料內(nèi)部加熱，因此其加熱效率更高，所以在180 ℃時其低聚木糖得率也較水熱處理法高。而且，在較低溫度如160、170 ℃時，其低聚木糖的產(chǎn)率也比水熱法在相同溫度下的高。與此同時，微波處理整個反應(yīng)所需時間僅為47 min(升溫2 min，保溫45 min)，而水熱處理法則需要85 min(升溫40 min，保溫45 min)。因此，微波處理法制備低聚木糖的效率較傳統(tǒng)的水熱處理有明顯提高。而當(dāng)反應(yīng)溫度高于180 ℃時，微波處理所得的低聚木糖的得率下降較快，也是因?yàn)槠浼訜崽匦运鶎?dǎo)致的。表1為所制備的低聚木糖的組成成分，包含聚合度從2到6的5種低聚木糖，其中，在反應(yīng)溫度較低時，高聚合度的低聚木糖較多，而隨著反應(yīng)溫度的上升，木二糖的得率明顯上升，而高聚合度的低聚木糖得率顯著下降。Nakahara等[12]報道生物質(zhì)自水解制備低聚木糖的降解機(jī)理：木聚糖中的側(cè)鏈?zhǔn)紫葦嗔眩缓笾麈湹摩?木糖苷鍵發(fā)生斷裂，生成長鏈的低聚木糖。而連接在糖鏈上的乙酰基則被解離，在水中形成乙酸以促進(jìn)降解，將長鏈的低聚木糖進(jìn)一步降解成短鏈的低聚木糖。在本研究中的最佳反應(yīng)條件180 ℃時，微波處理的木二糖至木六糖的比例為40.3%、23.4%、17.1%、12.5%和6.7%。而與之相比，水熱處理所得到的低聚木糖的組成比例有所不同，木四糖、木五糖、木六糖含量相對較高，這可能是由于加熱方式不同導(dǎo)致的。微波處理可以從反應(yīng)物內(nèi)部加熱，因而加熱效率較高，而水熱處理加熱需要由外而內(nèi)傳導(dǎo)熱量。因此，這可能導(dǎo)致其加熱并不均勻，進(jìn)一步導(dǎo)致低聚木糖在高溫下的過度降解。因此，在水熱反應(yīng)為200 ℃時，所產(chǎn)生的低聚木糖得率很低，約為6.2%，而其中木二糖占69.4%。有研究[13-14]表明，聚合度較低的低聚木糖相較于聚合度高的低聚木糖，其益生元活性更好，因此，如何在獲得高低聚木糖得率的同時降低其聚合度，有重要意義。從不同溫度下微波處理和水熱處理制備低聚木糖的對比不難看出，微波處理較水熱處理有較大優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在快速、高效、和高產(chǎn)率。

圖1 微波輔助法和水熱法制備低聚木糖的得率Fig.1 Yields of xylo-oligosaccharides obtained by microwave-assisted and hydrothermal treatment

圖2 微波處理和水熱處理的升溫曲線Fig.2 Heating curves of microwave and hydrothermal treatment

組分Component微波處理/% Microwave-assisted treatment 160 ℃170 ℃180 ℃190 ℃200 ℃水熱處理/% Hydrothermal treatment160 ℃170 ℃180 ℃190 ℃200 ℃木二糖 Xylobiose12.221.740.354.161.810.512.632.445.269.4木三糖 Xylotriose14.827.323.420.416.911.417.418.524.614.3木四糖 Xylotetrose13.425.117.113.28.423.127.323.811.06.1木五糖 Xylopentose31.913.512.57.79.121.822.712.87.52.6木六糖 Xyloshexos27.712.46.74.63.833.220.912.511.77.6

2.2 液體中的單糖

除了低聚木糖，微波處理和水熱處理所得液體中還含有多種單糖，包括木糖、阿拉伯糖和半乳糖(圖3)，其中阿拉伯糖和半乳糖為其在反應(yīng)液體中的質(zhì)量濃度，而木糖則為其相對于原料中半纖維素的得率。阿拉伯糖是植物半纖維素中廣泛存在的一種五碳糖，一般以支鏈連接在半纖維素木聚糖主鏈的C-2和C-3位。在水解反應(yīng)發(fā)生時，半纖維素的支鏈?zhǔn)紫葦嗔?，因此，阿拉伯糖支鏈?zhǔn)紫缺唤到獠⑷芙庠诜磻?yīng)液中。從圖3-a中可發(fā)現(xiàn)阿拉伯糖在反應(yīng)溫度較低時有較高質(zhì)量濃度，2種處理所得的最高質(zhì)量濃度均出現(xiàn)在反應(yīng)溫度為170 ℃時，而此時水熱處理液體中阿拉伯糖的質(zhì)量濃度較高。另一方面，當(dāng)反應(yīng)溫度為160 ℃，相對于低聚木糖的低得率，阿拉伯糖具有較高質(zhì)量濃度，也說明它在水解反應(yīng)中首先被降解。在溫度為160 ℃時微波處理中所獲得的阿拉伯糖質(zhì)量濃度較高，說明微波加熱的效率較高，而隨著溫度的增加，當(dāng)溫度超過170 ℃時微波反應(yīng)所得的阿拉伯糖質(zhì)量濃度迅速下降，也證明其加熱效率更好。相對而言，在較低溫度時水熱反應(yīng)所得的阿拉伯糖質(zhì)量濃度較低，而隨著溫度的不斷上升其質(zhì)量濃度下降較慢，表明微波處理較水熱處理在加熱效率上具有優(yōu)勢。半乳糖是竹材半纖維素中所含的另一種支鏈，其水解后的質(zhì)量濃度如圖3-b所示。其中，微波處理和水熱處理都在190 ℃得到最高半乳糖質(zhì)量濃度，而且水熱處理液體的半乳糖質(zhì)量濃度僅在200 ℃時比微波處理液體中的半乳糖質(zhì)量濃度高，這也是由微波處理的加熱特性導(dǎo)致的。而另一方面，半乳糖質(zhì)量濃度在低溫時較低而隨著溫度升高其濃度增大，表明相對于阿拉伯糖，在水解過程中半乳糖更難被降解，半乳糖與木糖主鏈的連接鍵更強(qiáng)。

木糖是生物質(zhì)自水解反應(yīng)中得到的最主要的一種單糖，它是由于半纖維素的木糖主鏈發(fā)生降解生成低聚木糖，而后低聚木糖中的糖苷鍵進(jìn)一步發(fā)生斷裂所得。因此其得率隨著反應(yīng)溫度的上升而明顯增加。由圖3-c可見，水熱處理所得的低聚木糖從160 ℃時的2.7%上升到190 ℃時的17.3%，而當(dāng)溫度上升至200 ℃時得率略微下降，為16.2%。而微波處理所得的木糖較少，在190 ℃時木糖得率為13.2%。水熱處理的木糖得率比微波處理高是因?yàn)樗疅崽幚砑訜嵝枰赏舛鴥?nèi)，有熱傳導(dǎo)過程，因此加熱不均勻，導(dǎo)致一部分低聚木糖過度水解。

a.阿拉伯糖 Arabinose；b.半乳糖 Galactose；c.木糖 Xylose

2.3 反應(yīng)副產(chǎn)物

除低聚木糖和單糖，生物質(zhì)的水解反應(yīng)還產(chǎn)生一定量的反應(yīng)副產(chǎn)物，主要包括甲酸、乙酸、糠醛和5-羥甲基糠醛，它們在產(chǎn)物液體中的質(zhì)量濃度如圖4所示。乙酸是微波處理和水熱處理中所獲得的最主要的一種反應(yīng)副產(chǎn)物，它主要來源于反應(yīng)過程中半纖維素中的乙酰基。在反應(yīng)過程中，一部分乙?；c木糖主鏈的連接鍵發(fā)生斷裂，在溶液中形成乙酸，乙酸又進(jìn)一步在溶液中生成水合氫離子，促進(jìn)半纖維素的降解。因此，原料中的乙酰基是自水解反應(yīng)能夠發(fā)生的重要因素，而采用堿法提取的半纖維素，因?yàn)樵谔崛∵^程中乙?；c木聚糖主鏈的酯鍵均被斷開，因此無法進(jìn)行自水解反應(yīng)以制備低聚木糖。本試驗(yàn)的溶液中乙酸質(zhì)量濃度隨著反應(yīng)溫度的上升而明顯提高，在200 ℃微波處理和水熱處理可以得到最高質(zhì)量濃度的乙酸，分別為2.66 g/L和3.05 g/L (圖3-a)。同時，在所有的反應(yīng)溫度下，水熱處理液體中的乙酸質(zhì)量濃度均比微波處理高，表明水熱處理可以降解更多的乙?；?。而關(guān)于低聚木糖在益生元作用的研究表明，乙酰化的低聚木糖較未含任何取代基的低聚木糖其益生元活性更好，因此，如何在獲得高低聚木糖產(chǎn)率的同時盡可能保留其乙?；?，有利于低聚木糖在食品和保健品領(lǐng)域的應(yīng)用[1,15-16]。與水熱處理比較，微波處理產(chǎn)生的乙酸少，表明有更多乙?；Ａ粼诘途勰咎巧?，因此其相對于水熱處理有一定優(yōu)勢。甲酸是反應(yīng)后液體中的另一種有機(jī)酸，主要來源于糖的降解產(chǎn)物如糠醛、5-羥甲基糠醛的進(jìn)一步裂解，因此在反應(yīng)液體中含量較少，其質(zhì)量濃度也隨著反應(yīng)溫度的升高而有所提高，其中微波處理和水熱處理均在200 ℃時獲得最高的甲酸質(zhì)量濃度，分別為0.31 g/L和0.37 g/L。而水熱處理質(zhì)量濃度更高，也是因?yàn)槠浼訜岵痪鶆蛩鶎?dǎo)致的。

糠醛是生物質(zhì)水解反應(yīng)中最主要的降解產(chǎn)物之一，它主要來自戊糖的降解，因此反應(yīng)液體中糠醛的質(zhì)量濃度隨溫度的升高而顯著上升。圖3-b中微波處理和水熱處理所得液體中糠醛的質(zhì)量濃度隨著反應(yīng)溫度的上升從最初的0.11 g/L和0.1 g/L 升至200 ℃時的3.34 g/L和4.17 g/L，說明當(dāng)反應(yīng)溫度過高時有大量的戊糖被降解，這對于低聚木糖的制備是不利的，因此要盡可能控制反應(yīng)溫度以降低糠醛的產(chǎn)生。在反應(yīng)溫度為180 ℃時，微波處理和水熱處理液體中所含的糠醛質(zhì)量濃度分別為0.45 g/L和0.62 g/L，相對于此時較高的低聚木糖得率(約30%)它們的質(zhì)量濃度并不高，而微波處理所得的糠醛質(zhì)量濃度更低，更有利于低聚木糖未來的應(yīng)用。5-羥甲基糠醛是反應(yīng)中己糖的降解產(chǎn)物，因?yàn)樯镔|(zhì)的自水解反應(yīng)在溫度低于200 ℃時對于纖維素組分影響較小，只有少部分纖維素能被降解成葡萄糖。因此，反應(yīng)液體中的5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度比糠醛低很多，在制備低聚木糖的最佳溫度時，反應(yīng)液體中的5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度僅為0.16 g/L(微波處理)和0.15 g/L(水熱處理)。即使溫度上升至200 ℃，相對于反應(yīng)液體中5-羥甲基糠醛的質(zhì)量濃度也并不高。

a.甲酸和乙酸 Formic acid and acetic acid；b.糠醛和羥甲基糠醛 Furfural and HMF

3 結(jié) 論

龍竹粉與去離子水混合分別通過微波輔助法和水熱法進(jìn)行處理以制備低聚木糖，在反應(yīng)溫度為180 ℃時可獲得最大低聚木糖產(chǎn)率。在該反應(yīng)溫度下，微波處理可制備得到31.4%低聚木糖，比水熱反應(yīng)高，且此時液體中的單糖和副產(chǎn)物質(zhì)量濃度也比水熱反應(yīng)更低。同時，微波處理的加熱效率和所需的反應(yīng)時間遠(yuǎn)低于水熱處理，可以大大縮短制備低聚木糖所需時間，而且其加熱更加均勻，有利于控制反應(yīng)，以制備更多的目標(biāo)產(chǎn)物。因此，采用微波輔助法降解生物質(zhì)制備低聚木糖有良好的前景。