文冠果種子蛋白質(zhì)提取及組分分析

宋宏新，劉 娟，薛海燕

( 陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

文冠果(Xanthocerassorbifolia)屬無患子科、落葉灌木或小喬木，是中國北方特有的珍稀木本油料植物果實(shí)[1]。由于其花美果豐，抗旱耐寒，在美化鄉(xiāng)村、治理荒山和水土保持工程中意義重大，因此被大量種植。文冠果種仁蛋白質(zhì)含量豐富，脂肪含量約55%～60%，多糖2%～3%，其油脂含90%以上的不飽和脂肪酸[2-4]，且含有多種中藥配方中的皂苷及活性化合物[5]，已有用于食用及輕化工產(chǎn)品的開發(fā)研究[6]。植物蛋白是素食者重要的蛋白來源[7-8]，營養(yǎng)與動(dòng)物蛋白相仿，但更易于人體消化。文冠果種子壓榨油脂后剩余的種粕中富含蛋白質(zhì)，其所含氨基酸種類齊全，且經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)研究表明，文冠果仁中蛋白質(zhì)利用率接近酪蛋白，超過經(jīng)特殊加工的濃縮大豆蛋白和葵籽蛋白[3,9]。但由于文冠果種子的基礎(chǔ)研究資料相對(duì)缺乏，食用歷史較短，作為新資源食品暫未獲得國家許可。近年來，中國文冠果育林及產(chǎn)果量持續(xù)增加，對(duì)文冠果油脂的加工利用研究也相應(yīng)增多，主要作為生物柴油與高級(jí)食用油進(jìn)行開發(fā)[10]，也有將其葉進(jìn)行加工作為涼茶的開發(fā)利用[11]，而對(duì)文冠果中的蛋白質(zhì)研究較少。因此，為充分利用文冠果種子資源，實(shí)現(xiàn)其高附加值的加工利用，為相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，對(duì)其種子蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的基礎(chǔ)分析研究十分必要。

以大豆為代表的植物種子大多以堿溶酸沉法提取分離種子蛋白質(zhì)，文冠果也有如此的提取研究，但對(duì)文冠果種子蛋白質(zhì)的系統(tǒng)研究分析報(bào)道甚少，有關(guān)其種子蛋白質(zhì)的組分及亞基種類與構(gòu)成資料缺乏。本研究采用溶劑浸提法對(duì)文冠果種子中的主要蛋白組分進(jìn)行提取定量及電泳定性分析，旨在為文冠果種子蛋白提取工藝的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)，為文冠果資源的充分開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

文冠果購于陜西文冠果實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司(產(chǎn)于陜西淳化)，去除果殼后，將種子冷藏備用。

試劑：NaOH、石油醚(30～60 ℃)、乙醇、NaCl(均為分析純)；N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(美國Sigma公司)；Tris-base、甘氨酸(美國Amresco公司)；SDS(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)；N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(美國Amersham公司)；β-巰基乙醇(上海源葉生物科技有限公司)；考馬斯亮藍(lán)R-250(加拿大Bio Basic公司)。

1.2 儀 器

真空冷凍干燥機(jī)(DZF-6020 上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；自動(dòng)凱氏定氮儀(KN520 濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司)；石墨消解儀(SH220 濟(jì)南海能儀器股份有限公司)；水浴振蕩器(HZS-HA 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(HC-3018R 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(GIS400 南京馳順科技有限公司)。

1.3 文冠果種子蛋白的提取

1.3.1 文冠果種子蛋白組分的提取 采用連續(xù)分級(jí)提取法[12]提取文冠果種子蛋白組分。原料的脫脂處理：文冠果種子經(jīng)人工去殼，粉碎后，采用石油醚進(jìn)行脫脂處理，按料液比(1∶10)加入石油醚(沸程：30～60 ℃)，采用超聲波清洗器超聲20 min，于5 000 r/min離心5 min，重復(fù)2次，將沉淀置于通風(fēng)櫥直至溶劑揮發(fā)完全，得到文冠果種子脫脂粉，4 ℃下密封冷藏。

采用4種溶劑(H2O、φ=10%NaCl、φ=75%乙醇及φ=0.2%NaOH)依次連續(xù)分級(jí)提取蛋白質(zhì)，根據(jù)各蛋白組分在不同溶劑中的溶解性差異進(jìn)行分級(jí)提取，分析文冠果種子蛋白組分構(gòu)成。

清蛋白的提?。簻?zhǔn)確稱取脫脂粉1.50 g，放入50 mL離心管中，加入20 mLH2O，置搖床上震蕩2 h，于4 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液作為一次提取樣待測(cè)。再向沉淀中加入10 mL H2O提取，震蕩，離心，收集上清液，合并兩次上清液作為2次提取樣待測(cè)。重復(fù)第2次的步驟，合并3次上清液作為3次提取樣待測(cè)。

球蛋白的提?。合蛱崛∏宓鞍缀蟮某恋碇屑尤毽?10%NaCl，3次提取步驟及溶劑用量同清蛋白提取操作，分別得到球蛋白3次提取液樣待測(cè)。

向提取球蛋白后的沉淀中加入φ=75%乙醇，向提取醇溶蛋白后的沉淀中加入φ=0.2%NaOH，同上操作，分別得到醇溶蛋白和谷蛋白提取液樣待測(cè)。

1.3.2 一次直接提取法提取文冠果種子蛋白 采用一次直接提取法提取蛋白[13]：準(zhǔn)確稱取脫脂粉1.50 g，分別采用4種溶劑(H2O、φ=10%NaCl、φ=75%乙醇及φ=0.2%NaOH)作為溶劑浸提劑，研究單一溶解對(duì)4種蛋白的一次性直接提取。提取操作程序同連續(xù)分級(jí)提取法中清蛋白的提取步驟，分別得到水溶蛋白、鹽溶蛋白、醇溶蛋白和堿溶蛋白的3個(gè)不同體積的提取液，-20 ℃下保存，備用。依據(jù)公式(1)計(jì)算蛋白提取率。

蛋白提取率=提取液中的蛋白量/總蛋白量×100%

(1)

1.3.3 堿溶酸沉法提取文冠果種子蛋白 堿溶酸沉法提取蛋白[14]：準(zhǔn)確稱取5.00 g脫脂粉與55 mL超純水混合，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至11.0，在41 ℃下恒溫磁力攪拌浸提30 min，離心20 min，得到蛋白提取液，重復(fù)以上步驟，合并2次提取液(剩余殘?jiān)鋬龈稍锖蟠郎y(cè))，用1 mol/L的HCl溶液調(diào)至pH 4.6，離心(收集上清液，待測(cè))；加入適量超純水將沉淀溶解，再用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，進(jìn)行冷凍干燥后即得蛋白粉，稱量后低溫保存。

將提取過程中各保留樣品用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量，并依據(jù)公式(2)計(jì)算蛋白得率。

蛋白得率=(蛋白粉質(zhì)量×蛋白粉純度)/脫脂粉質(zhì)量×100%

(2)

1.4 文冠果種子蛋白的定量和定性分析

1.4.1 凱氏定氮定量分析 采用凱氏定氮儀分別對(duì)各蛋白組分提取液進(jìn)行蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定[15]，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化系數(shù)取6.25。

1.4.2 SDS-PAGE電泳定性分析 電泳樣品制備：分別量取連續(xù)分級(jí)提取出的4種蛋白組分提取液，以1∶1的體積比加入2×SDS樣品緩沖液(含巰基乙醇)，其中蛋白粉和脫脂粉樣品加入適量的樣品緩沖液調(diào)整其蛋白質(zhì)量濃度至10 mg/mL，搖勻，100 ℃煮沸5 min，于3 000 r/min離心5 min，點(diǎn)樣[16]。

電泳條件：凝膠電泳的分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%[17]，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、蛋白粉、脫脂粉的點(diǎn)樣量分別為13、12、15、12、8、8 μL。

在恒定電流30 mA條件下進(jìn)行電泳，考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行染色，脫色液進(jìn)行脫色。之后用凝膠成像儀進(jìn)行圖像掃描，并分析電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果種子粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

根據(jù)凱氏定氮法測(cè)定去殼后的文冠果種子中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.29%±0.05%，采用索氏抽提法測(cè)得種子中粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為57.67%±0.02%，經(jīng)脫脂后測(cè)得脫脂粉中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.04%±0.01%。結(jié)果顯示，文冠果種子中富含脂肪和蛋白質(zhì)，脫脂粉中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，文冠果種子目前主要開發(fā)利用脂肪，然而，脫脂后的剩余籽粕可作為優(yōu)質(zhì)蛋白資源進(jìn)行開發(fā)。

2.2 文冠果種子蛋白定量分析

2.2.1 連續(xù)分級(jí)提取法提取文冠果種蛋白組分 以文冠果種子脫脂粉為提取原料，采用4種提取劑依次連續(xù)分級(jí)提取蛋白質(zhì)，4種蛋白組分的3個(gè)不同體積提取液進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，計(jì)算脫脂粉中的各蛋白組分含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 連續(xù)分級(jí)提取蛋白組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.1 Protein component mass fraction by sequential extraction

由圖1可知，3個(gè)提取階段中4種蛋白組分的蛋白含量均呈現(xiàn)出依次增加的趨勢(shì)，但在第3次的提取中蛋白增加量變少，因此確定提取次數(shù)為3次。經(jīng)測(cè)定，分級(jí)提取法提取得出文冠果種子脫脂粉中各蛋白組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由大到小依次為：球蛋白26.38%、清蛋白21.50%、谷蛋白2.49%、醇溶蛋白1.99%。通過計(jì)算得出采用溶劑分級(jí)提取法提取出的蛋白組分總量為52.36%，即提取率為84.40%，說明該方法能完整的分離出各主要蛋白組分。對(duì)各類不同溶解性蛋白的組成比例進(jìn)行分析，表明文冠果種子蛋白具有較好的水溶性，為其進(jìn)一步高效率的提取與加工工藝提供良好的參考依據(jù)。

2.2.2 一次直接提取法提取文冠果種子蛋白 采用4種提取劑一次性直接對(duì)脫脂粉進(jìn)行提取，4種提取液得到的3個(gè)不同體積樣品的蛋白質(zhì)定量，計(jì)算提取蛋白質(zhì)在脫脂粉中質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖2，計(jì)算提取率(提取蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的比率)，結(jié)果見表2。

圖2 一次直接提取蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.2 Protein component mass fraction by direct extraction

由圖2可知，一次直接提取法提取得出文冠果種子中的堿溶蛋白含量最多，而醇溶蛋白含量最少。4種蛋白在3次提取中均呈現(xiàn)蛋白含量遞增的趨勢(shì)，第3次提取結(jié)果增加的趨勢(shì)平緩，因此確定提取次數(shù)為3次。經(jīng)測(cè)定，一次直接提取法提取得出文冠果種子脫脂粉中各蛋白的提取量(以1.00 g 脫脂粉為提取原料計(jì)算)及提取率由大到小依次為：堿溶蛋白0.496 9 g和80.09%、鹽溶蛋白0.468 8 g和75.57%、水溶蛋白0.214 8 g和34.63%、醇溶蛋白0.045 0 g和7.26%。由此得出采用堿溶液提取蛋白的提取率最高，可提取80%以上的蛋白質(zhì)。

對(duì)以上2種提取方法進(jìn)行比較得出，一次直接提取法得出的鹽溶蛋白含量相較分級(jí)提取出的球蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，是由于其中包含了部分水溶蛋白；而堿溶蛋白與分級(jí)提取出的谷蛋白結(jié)果相比質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，是由于堿溶液提取過程中包含了部分清蛋白與球蛋白。分級(jí)提取法能有效的將4種蛋白組分分離，為進(jìn)一步辨別及定性分析各蛋白組分奠定基礎(chǔ)；而一次直接提取法的結(jié)果表明利用堿性溶劑提取文冠果種子蛋白更為高效，為文冠果蛋白的提取加工提供了科學(xué)依據(jù)。

2.2.3 堿溶酸沉法提取文冠果種子蛋白 以文冠果種子脫脂粉為原料，采用堿溶酸沉法提取蛋白，經(jīng)真空冷凍干燥后，依據(jù)凱氏定氮法對(duì)該試驗(yàn)提取過程中各部分蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行定量測(cè)定，經(jīng)測(cè)定得出提取液中的蛋白質(zhì)量為0.521 5±0.000 6 g，依據(jù)公式(1)計(jì)算可得，采用堿溶酸沉法提取文冠果種蛋白的提取率為84.06%，較一次直接提取法中的蛋白提取率高。

通過進(jìn)一步對(duì)堿溶酸沉法得到的提取殘?jiān)⒊恋砗笊锨逡汉偷鞍踪|(zhì)粉進(jìn)行定量計(jì)算(表1)，該方法得到沉淀干燥蛋白粉的純度為83.92%，由公式(2)計(jì)算出蛋白得率為36.40%，其結(jié)果與孔維寶等[18]采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化研究結(jié)果相當(dāng)。

表1 堿溶酸沉法各步驟樣品蛋白質(zhì)定量結(jié)果Table 1 Quantitative results of protein in each step by alkali-solution and acid-isolation extraction

通過表1計(jì)算提取過程3個(gè)樣品蛋白質(zhì)總量，與實(shí)際測(cè)得總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.04%的結(jié)果相符，該法得到了種子中58.70%的蛋白質(zhì)，殘?jiān)Ｓ嗟鞍踪|(zhì)占比為12.90%，提取液未沉淀(上清液)蛋白質(zhì)占比為28.40%。由結(jié)果可知，要提高蛋白得率，對(duì)堿液提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)在研究蛋白質(zhì)特性表征基礎(chǔ)上，優(yōu)化酸沉條件，從而達(dá)到減少損失的目的。

2.3 文冠果種子蛋白SDS-PAGE分析

對(duì)試驗(yàn)中文冠果種子蛋白質(zhì)5個(gè)樣品、脫脂粉及蛋白Maker的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖3所示。

根據(jù)選用的蛋白Maker(分子質(zhì)量依次為：118、90、50、34、26、19 ku)電泳后的遷移率及其分子量確定出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)圖譜中蛋白遷移率計(jì)算出圖譜中各蛋白的主要亞基分子質(zhì)量。并使用Image J軟件分析電泳圖譜中的蛋白條帶灰度值，計(jì)算其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

a.清蛋白 Albumin；b.球蛋白 Globulin；c.醇溶蛋白 Gliadin；d.谷蛋白 Glutenin；e.蛋白粉 Protein powder；f.脫脂粉 DefattedXanthocerasseeds；g.Maker

圖3 文冠果種子蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis analysis of Xanthoceras seeds protein

理論上種子脫脂粉包含了文冠果種子全部的蛋白質(zhì)(簡稱總蛋白)，圖3的電泳圖譜顯示，該泳道(f)電泳條帶最多，可以鑒定為10個(gè)，各亞基分子質(zhì)量及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表2所示，其亞基分子質(zhì)量分布于20～60 ku，包含3個(gè)主條帶，其分子質(zhì)量分別為25.76、38.05和56.76 ku。

對(duì)比4種蛋白組分與脫脂粉的電泳圖譜可得，其中清蛋白(泳道a)的條帶顯示最多，且分布廣，包含7個(gè)條帶，2條主帶的分子質(zhì)量分別為25.76和38.05 ku，表明文冠果種中的蛋白質(zhì)具有較好的水溶性。球蛋白(泳道b)含4個(gè)條帶，其中38.05和56.76 ku為高含量亞基。谷蛋白(泳道d)含3個(gè)條帶，兩條主帶為25.76 ku和38.05 ku。而醇溶蛋白(泳道c)由于蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，條帶模糊，僅有18.74 ku明顯可見。通過比較分析可以看出相對(duì)分子質(zhì)量為38.05 ku的蛋白亞基在4種提取溶劑中均呈現(xiàn)出較高的溶解度，表明該蛋白亞基質(zhì)量分?jǐn)?shù)較多；相對(duì)分子質(zhì)量為25.76 ku的蛋白亞基在水溶液以及堿溶液中的溶解度較高。

堿溶酸沉得到的蛋白粉包含了文冠果種子絕大部分的蛋白質(zhì)，蛋白粉(泳道e)電泳可鑒定8個(gè)條帶的亞基分子質(zhì)量及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表2所示，其中2個(gè)主條帶的分子量分別為38.05和56.76 ku。與總蛋白進(jìn)行對(duì)比可以看出，堿溶酸沉法提取出的蛋白中分子質(zhì)量為25.76 ku的蛋白亞基質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，而該亞基卻顯示為谷蛋白中的一條主帶，可能是由于提取液的濃度或酸沉不充分導(dǎo)致。由此可得，為保證提取蛋白的完整性，應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化堿溶酸沉法提取蛋白過程中的提取條件。

3 結(jié) 論

采用連續(xù)分級(jí)提取法分離得出文冠果種子脫脂粉中球蛋白及清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較多，一次直接提取法得出采用堿溶液可高效提取文冠果種蛋白，堿溶酸沉法的蛋白提取率可達(dá)84.06%，并得到純度為83.92%的蛋白粉。對(duì)比直接浸提法與堿溶酸沉法的蛋白提取率，表明堿溶酸沉法提取蛋白的提取效率高，操作條件易于控制，便于工業(yè)化放大生產(chǎn)文冠果種蛋白粉。通過SDS-PAGE電泳對(duì)提取出的蛋白分析得出文冠果種子蛋白質(zhì)包含有10種亞基，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大的亞基分子質(zhì)量為：56.76、38.05和25.76 ku。有關(guān)文冠果種子蛋白質(zhì)的營養(yǎng)安全與加工工藝特性還有待深入研究。然而，文冠果作為一種亟待開發(fā)的優(yōu)質(zhì)蛋白源，對(duì)其種子蛋白組分及溶解提取特性的研究，為實(shí)現(xiàn)對(duì)其高效的工業(yè)化提取蛋白，并進(jìn)一步應(yīng)用于食品行業(yè)提供了基礎(chǔ)。