甘肅旱地春小麥及部分重要骨干親本麥谷蛋白亞基組成分析

陳 琛,王 煒,袁俊秀,陳 軍,牟麗明

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 小麥研究所， 蘭州 730070；3.定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅定西 743000)

旱地小麥?zhǔn)歉拭C省小麥的主體，約占全省小麥種植面積的75%左右[1]，主要分布在慶陽、平?jīng)?、天水、隴南4個(gè)地區(qū)[2]。提高產(chǎn)量一直是小麥遺傳改良的主要目標(biāo)。近年來，甘肅省在“穩(wěn)面積提單產(chǎn)”的策略下，小麥單產(chǎn)水平已獲得很大程度的提升[3]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平提高，市場對小麥品質(zhì)，尤其是加工品質(zhì)的要求愈高。小麥加工品質(zhì)逐步成為育種的重要目標(biāo)[4]。

小麥麥谷蛋白亞基組成和含量與小麥加工品質(zhì)密切相關(guān)。麥谷蛋白在還原狀態(tài)下，根據(jù)SDS-PAGE中遷移率的不同又分為高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基 (HMW-GS)和低分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)兩類[5]。HMW-GS由位于第一同源組群的1A、1B和1D 染色體長臂近著絲點(diǎn)處的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位點(diǎn)的基因編碼[6]，研究認(rèn)為HMW-GS主要影響面團(tuán)的彈性；而LMW-GS則由位于第一同源組群染色體短臂的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點(diǎn)的基因編碼[7]，對小麥彈性及品質(zhì)具有重要作用[8]。由于LMW-GS 變異豐富，鑒定方法困難，國內(nèi)外對LMW-GS研究程度遠(yuǎn)不如HMW-GS。直到Wang等[9-10]開發(fā)了7個(gè)和10個(gè)用于鑒定Glu-A3和Glu-B3位點(diǎn)等位基因的STS標(biāo)記，并進(jìn)行了驗(yàn)證，才使低分子質(zhì)量亞基能夠被相對準(zhǔn)確地檢測并用于育種工作。Glu-1和Glu-3位點(diǎn)對和面特性存在加性和互作效應(yīng)，應(yīng)綜合考慮HMW-GS和LMW-GS 對小麥加工品質(zhì)的影響，才能準(zhǔn)確評價(jià)LMW-GS等位變異對小麥品質(zhì)的效應(yīng)[11-12]。

有關(guān)甘肅小麥品種HMW-GS組成的研究表明，甘肅小麥與國內(nèi)主產(chǎn)區(qū)小麥品種在品質(zhì)上有較大差異[1]。如李望鴻等[13]對甘肅小麥地方品種和早期甘肅主栽品種HMW-GS組成進(jìn)行分析，結(jié)論是甘肅小麥優(yōu)質(zhì)亞基的頻率較低，小麥加工品質(zhì)普遍低劣。但上述研究所選樣本及研究年代都較為久遠(yuǎn)，近年來有關(guān)甘肅主栽小麥麥谷蛋白亞基組成及分布的研究非常少見。有關(guān)小麥麥谷蛋白的研究和報(bào)道也多集中在高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基，而關(guān)于LMW-GS的研究也比較少。因此，本研究針對已開發(fā)可用于育種的高、低分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基功能標(biāo)記，選取公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)亞基AxNull、Dx5、Bx7、By8和Bx14 5個(gè)高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基和 Glu-A3d、Glu-B3b 2個(gè)低分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基，對甘肅近年育成的旱地春小麥品種(系)及部分重要骨干親本共82份材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，明確這些材料中優(yōu)質(zhì)HMW-GS和LMW-GS分布及組成情況，旨在了解和掌握甘肅近年來育成旱地春小麥品種(系)的品質(zhì)改良效應(yīng)，為甘肅小麥品質(zhì)改良工作提供材料和參考信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘肅省旱地春小麥品種(系)及部分重要骨干親本共82份，主要來自隴東、河西和中部麥區(qū)3個(gè)旱作地區(qū)主栽春小麥品種(系)，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、小麥研究所、旱地農(nóng)業(yè)研究所，定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院等單位提供。其中育成品種(系)65份，包括‘定西16號’‘定西17號’‘定西18號’等16個(gè)定西系列旱地小麥品種，‘會(huì)寧3號’‘會(huì)寧12號’‘會(huì)寧13號’‘會(huì)寧15號’4個(gè)會(huì)寧系列旱地品種，‘隴春27’‘隴春35’‘隴春40’‘岷春4號’‘岷春20號’‘岷春21號’以及旱地春小麥品系‘節(jié)水1233’‘節(jié)水8028’‘節(jié)水9701’‘節(jié)水9809’等。引進(jìn)品種(系)12份，包括引自青海省的‘高原356’‘高原448’‘高原465’，引自黑龍江省的‘墾紅14’‘墾紅19’‘龍麥29’‘龍麥30’等。農(nóng)家品種5份。

1.2 試驗(yàn)步驟

基因組DNA提?。哼x取每份材料飽滿種子若干粒，室溫下在培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽，待幼苗長度約 5 cm 時(shí)，根據(jù)Edwards等[14]報(bào)道的CTAB法提取小麥基因組DNA，用于基因位點(diǎn)檢測。 PCR反應(yīng)和電泳：特異性分子標(biāo)記的引物序列、大小及相關(guān)信息見表1。

表1 分子標(biāo)記PCR引物序列Table 1 The sequences and amplification fragments sizes of HMW-GS primers

PCR反應(yīng)體系15 μL，包括2×TaqMasterMix 7.5 μL(中科瑞泰北京生物科技有限公司)，標(biāo)記基因上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL(上海生工生物工程股份有限公司)，模板DNA 50 ng，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至15 μL。Dx5、Bx7、By8的PCR擴(kuò)增程序參照蘆靜等[20]的方法進(jìn)行，AxNull的擴(kuò)增程序參照Lafiandra等[15]的方法，Bx14的擴(kuò)增程序參照王欣等[19]的方法， Glu-A3d和Glu-B3b的擴(kuò)增程序參照Kolster等[11]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠中加入EB染色。緩沖體系為1×TAE溶液，120V電壓電泳30 min，此后用紫外成像系統(tǒng)掃描成像并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘肅旱地春小麥品種(系)及部分重要骨干親本HMW-GS分子檢測

電泳結(jié)果如圖1，在Glu-A1位點(diǎn)，35份材料擴(kuò)增出920 bp的DNA條帶(圖1-A)，說明含有Null，由于Glu-A1位點(diǎn)通常只編碼3種亞基，即Ax1、Ax2*和AxNull[15]，因此，含有Ax1/Ax2* 的材料有47份，分布頻率為57.3%；Glu-B1位點(diǎn)的亞基以7+8為主，共有59份材料同時(shí)擴(kuò)增出630/766 bp和527 bp的DNA片段(圖1-C、1-D)，分布頻率為72.0%；在‘定西17’‘定西19’等4份材料擴(kuò)增出407 bp的DNA條帶，說明含有稀有亞基Bx14(圖1-E)，分布頻率為4.9%。其中在‘定西18’‘岷春21’‘甘春21’和‘西旱1號’等15份材料中檢測到了稀有亞基7，在‘大紅芒’‘節(jié)水1233’這2個(gè)品種中檢測到稀有亞基8，分布頻率分別為18.3%和2.4%。在Glu-D1位點(diǎn)，26份材料擴(kuò)增出450 bp的DNA條帶(圖1-B)，說明含有Dx5，分布頻率為31.7%。

Marker DL2000；A. Null亞基(920 bp) Subunit Null (920 bp)；B. Dx5亞基(450 bp) Subunit Dx5(450 bp)；C. Bx7亞基(630/766 bp) Subunit Bx7(630/766 bp)；D. By8亞基(527 bp) Subunit By8(527 bp)；E. Bx14亞基(407 bp) Subunit Bx14(407 bp)

圖1部分材料HMW-GS的PCR產(chǎn)物電泳圖
Fig.1ElectrophoresisofPCRamplifiedfragmentsofHMW-GS

由表2可知，Glu-A1位點(diǎn)的Ax1/2*在育成品種中頻率為61.5%，高于引進(jìn)品種近1倍。7+8亞基在育成品種和引進(jìn)品種的頻率依次是73.8%和66.7%，為Glu-B1位點(diǎn)的優(yōu)勢亞基。這個(gè)比例在定西系列育成品種中高達(dá)81%，會(huì)寧系列品種中高達(dá)100%。稀有亞基7在育成品種和引進(jìn)品種分別占16.9%和25.0%。而品質(zhì)較好的14+15分別只占4.6%和8.3%。稀有亞基8在1份育成品種中檢測到，引進(jìn)品種中沒有發(fā)現(xiàn)。Glu-D1位點(diǎn)的5+10亞基在育成品種中的頻率是30.8%，低于引進(jìn)品種近20%。

表2 不同來源的甘肅主栽旱地春小麥HMW-GS分布頻率Table 2 Frequencies of HMW-GS glutenin subunits in spring wheat varieties cultivated in Gansu province

組合方式上，2個(gè)位點(diǎn)具有優(yōu)質(zhì)亞基的組合以(Ax1/2*，7+8)組合為主，共29份材料檢出，頻率為35.4%。其中育成品種、引進(jìn)品種頻率分別是40%、8.3%。其次是(Ax1/2*，5+10)組合共19份材料，頻率為23.2%，育成品種和引進(jìn)品種分別占24.6%和25%，農(nóng)家品種中沒有這種組合。15份材料中檢測出(7+8，5+10)組合，頻率是18.3%，育成品種、引進(jìn)品種的頻率分別是18.5%和25%，農(nóng)家品種中也沒有檢測出這種組合。3個(gè)位點(diǎn)都具優(yōu)質(zhì)亞基的材料有11份，其中(Ax1/2*，7+8，5+10)組合10份，9份為育成品種(系)，1份為引進(jìn)品種。(Ax1/2*，14+15，5+10)組合僅有1份(表3)。

表3 Glu-1 3個(gè)位點(diǎn)具優(yōu)質(zhì)亞基的小麥品種(系)Table 3 Wheat varieties(lines) with three good quality subunits located at Glu-1 locus

2.2 甘肅旱地春小麥品種(系)及部分重要骨干親本LMW-GS分子檢測

由表4可知，在Glu-A3位點(diǎn)，66份材料擴(kuò)增出967 bp的DNA片段， Glu-A3d以 80.5%的頻率成為Glu-A3位點(diǎn)的優(yōu)勢亞基(圖2-A)。76.9%的育成品種含有 Glu-A3d亞基，供此次試驗(yàn)所用的引進(jìn)品種100%具有 Glu-A3d亞基。在Glu-B3位點(diǎn)，35份材料擴(kuò)增出1 570 bp的DNA片段，說明具有Glu-B3b亞基，分布頻率為42.7%(圖2-B)。41.5%的育成品種和58.3%的引進(jìn)品種具有Glu-B3b亞基。( Glu-A3d，Glu-B3b)組合在供試材料中所占比例為37.8%。He等[21]研究指出，對面團(tuán)的延展性作用，Glu-B3d和Glu-B3b等位基因比其他的等位基因大。對中國干白面條的品質(zhì)來說， Glu-A3d 和 Glu-B3d較其他等位基因稍大[22]。從試驗(yàn)結(jié)果看出，育成品種的LMW-GS略低于引進(jìn)品種，但總體來說，甘肅旱地春小麥及部分重要骨干親本在LMW-GS上占有較大優(yōu)勢。

表4 不同來源的甘肅主栽旱地春小麥LMW-GS分布頻率Table 4 Frequencies of LMW-GS glutenin subunits in spring wheat varieties cultivated in Gansu province

Marker DL2000；A. Glu-A3d亞基(967 bp) Subunit Glu-A3d(967 bp)；B. Glu-B3b亞基(1 570 bp) Subunit Glu-B3b(1 570 bp)

圖2部分材料LMW-GS的PCR產(chǎn)物電泳圖
Fig.2ElectrophoresisofPCRamplifiedfragmentsofLMW-GS

2.3 HMW-GS與LMW-GS在供試材料中的組合分布

將HMW和 LMW麥谷蛋白亞基組合方式進(jìn)行分析，結(jié)果表明供試的82份小麥品種(系)中在3個(gè)位點(diǎn)含優(yōu)質(zhì)亞基的組合以(Ax1/2*、7+8、 Glu-A3d)為主，所占比例為29.3%。在4個(gè)位點(diǎn)含優(yōu)質(zhì)亞基的組合以(5+10、7+8、 Glu-A3d、Glu-B3b)和(Ax1/2*、5+10、7+8、 Glu-A3d)為主，比例分別為8.3%、6.1%。在5個(gè)位點(diǎn)含優(yōu)質(zhì)亞基的材料有8份，組合類型有(Ax1/2*、5+10、7+8、 Glu-A3d、Glu-B3b)、(Null、5+10、7+8、 Glu-A3d、Glu-B3b)和(Ax1/2*、5+10、14+15、 Glu-A3d、Glu-B3b)3種，分別在4份、3份、1份材料中檢測出。

2.4 經(jīng)典品種的亞基組成

由表5可知，本研究的供試材料主要為甘肅近年育成的旱地春小麥品種(系)及部分重要骨干親本，其中有一些經(jīng)典品種如‘隴輻2號’‘西旱1號’‘隴春27號’‘定西38號’以及引進(jìn)的‘龍麥30’‘墾紅14’‘高原356’，都是公認(rèn)的優(yōu)良抗旱品種，在育種工作中常被選作親本。因此，明確經(jīng)典品種的麥谷蛋白亞基組成十分必要。

表5 經(jīng)典品種的亞基組成Table 5 Composition of high quality subunits in classic varieties

3 討 論

前人研究麥谷蛋白的方法多為SDS-PAGE，該方法一般以成熟籽?；蛎娣蹫闃悠?，檢測成本較高，工作量大，并且很難準(zhǔn)確區(qū)分分子質(zhì)量相近的亞基。本研究所用的分子標(biāo)記法在成本和工作量上相較于SDS-PAGE法都大大減少，利用引物的特異性，僅根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳條帶的有無就能判斷相應(yīng)亞基，鑒定結(jié)果比蛋白質(zhì)電泳結(jié)果更為準(zhǔn)確直觀。

和以往研究相比，甘肅近年主栽春小麥的優(yōu)質(zhì)麥谷蛋白亞基已有了明顯提升。就5+10亞基來說，李望鴻等[13]在2010年對甘肅部分春小麥研究表明，優(yōu)質(zhì)亞基5+10的頻率分別為9.0%；葉春雷等[23]在2012年對甘肅省春小麥育成品種研究表明5+10的頻率略有升高，為10.7%。此次研究中5+10亞基的頻率為31.7%，明顯高于早期品種。

Payne等[7]研究認(rèn)為，不同位點(diǎn)編碼的 HMW-GS對小麥品質(zhì)的效應(yīng)不同。本試驗(yàn)選取的5個(gè)HMW-GS是根據(jù)高翔[24]對不同亞基對小麥品質(zhì)影響大小研究結(jié)果，選取了Glu-Al 位點(diǎn)的1/2*，Glu-Bl 位點(diǎn)的14+15和7+8，Glu-Dl 位點(diǎn)的5+10幾個(gè)公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)亞基。另外，Payne等[25]在1983年的研究表明，HMW-GS 3個(gè)位點(diǎn)對小麥品質(zhì)的影響具有加性效應(yīng)，毛沛等[26]對1 600余份國內(nèi)小麥研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，即對于小麥品種來講，它含有的 HMW-GS 數(shù)目越多，它的品質(zhì)就越好。從本研究的結(jié)果來看，甘肅近年育成旱地春小麥及部分重要骨干親本在單個(gè)亞基的分布頻率都較高，但亞基組合的頻率偏低，這也是導(dǎo)致甘肅小麥加工品質(zhì)不高的一個(gè)原因。

目前，國內(nèi)外關(guān)于LMW-GS的研究還遠(yuǎn)不如對HMW-GS的研究。事實(shí)上，LMW-GS約占整個(gè)種子貯藏蛋白的1/3，占麥谷蛋白的60%，對小麥品質(zhì)性狀有重要影響。因此，僅以HMW-GS評價(jià)小麥品質(zhì)是片面且不夠準(zhǔn)確的。朱金寶等[27]研究表明，小麥加工品質(zhì)的好壞既受HMW-GS的影響，也與LMW-GS有關(guān)，兩者之間相互作用共同影響著小麥的品質(zhì)。與以往單純以HMW-GS評價(jià)小麥相比，本試驗(yàn)將LMW-GS與HMW-GS綜合研究，試驗(yàn)中選取的2個(gè)LMW-GS分別是 Glu-A3d和Glu-B3b，也是經(jīng)前人研究得出的優(yōu)質(zhì)亞基。結(jié)果表明甘肅省主栽旱地小麥的 Glu-A3d和Glu-B3b比例分別是80.5%和42.7%?？梢?，在LMW-GS單個(gè)亞基上，甘肅旱地春小麥占有較高的比例，這種優(yōu)勢在育種工作中應(yīng)當(dāng)予以保留和利用，但是LMW-GS與HMW-GS的組合頻率遠(yuǎn)低于單個(gè)亞基的頻率。導(dǎo)致這種結(jié)果的因素有很多，其中一個(gè)原因可能是多年來甘肅小麥育種只注重產(chǎn)量的提高而忽視品質(zhì)的改善，即使在品質(zhì)改良中，也較多注重 HMW-GS的研究而忽略了LMW-GS對品質(zhì)的重要影響，鮮有綜合評價(jià)LMW-GS與HMW-GS的研究。本研究不僅鑒定HMW-GS的分布情況，而且對LMW-GS的分布頻率也進(jìn)行研究鑒定，加強(qiáng)甘肅小麥育種工作中的這一薄弱點(diǎn)，對小麥品質(zhì)改良提供了新的育種信息。此次研究中篩選出8份在5個(gè)位點(diǎn)具優(yōu)質(zhì)亞基的材料，這些材料在以后的育種工作中將得到充分利用。

4 結(jié) 論

本研究采用STS分子標(biāo)記的方法，對82份甘肅主栽旱地春小麥品種(系)及部分重要骨干親本進(jìn)行了檢測分析，明確了HMW-GS與LMW-GS優(yōu)質(zhì)亞基分布頻率。甘肅近年主栽旱地春小麥單個(gè)優(yōu)質(zhì)亞基的分布頻率與早期甘肅春小麥品種相比有了明顯提升，尤其在LMW-GS具有較大優(yōu)勢。但亞基組合的頻率偏低且種類較單一，導(dǎo)致甘肅小麥的加工品質(zhì)還是不高。在今后的小麥品質(zhì)育種工作中還需加強(qiáng)對現(xiàn)有優(yōu)勢的利用和存在問題的解決。