納米細菌對腎小管上皮細胞損傷在腎結(jié)石形成中作用的研究

王議鶴，王勤章，吳 雙，申茂磊，褚 浩，錢 成，錢 彪*

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病之一［1］，該病的成因非常復雜，納米細菌（nanobacteria，NB）感染被認為是結(jié)石形成的主要原因之一［2-3］，其在腎結(jié)石患者的血液、尿液和結(jié)石中的陽性檢出率均在90%以上［4-5］。NB是一種具有超微結(jié)構(gòu)的人體病原菌，具有較強的感染能力，能在菌體外周形成羥磷灰石結(jié)晶外殼，黏附并損害集合管上皮細胞及腎乳頭細胞，從而形成結(jié)石［6］。

隨著醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，結(jié)石診療有了長足的進步，但碎石治療后患者的結(jié)石復發(fā)率仍然很高［7］。因此，探究泌尿系結(jié)石的形成機制以尋找新的治療手段是當前臨床中亟待解決的難題。四環(huán)素是為數(shù)不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一，SHOSKES等［8］研究了四環(huán)素對NB相關(guān)慢性前列腺結(jié)石患者的治療效果，其中80%患者的癥狀在治療3個月后得到了極大改善，10例患者的結(jié)石縮小50%。然而，目前并不清楚NB如何在腎結(jié)石形成過程中發(fā)揮其獨特作用。本課題旨在通過研究NB損傷人腎小管上皮細胞（HK-2細胞）導致晶體滯留的機制以及四環(huán)素對這一過程的抑制作用，以期為泌尿系結(jié)石的預防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 HK-2細胞購自武漢大學保藏中心。DMEM培養(yǎng)基，1640培養(yǎng)基，胎牛血清，磷酸鹽緩沖液（PBS），HEPES緩沖液，一水草酸鈣（COM），納米級羥基磷灰石（nHAP），四環(huán)素，過氧化氫（H2O2）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、Na+/K+ATP酶試劑盒、Ca2+/Mg2+ATP酶試劑盒，phalloidin-FITC。細胞孵育箱，倒置相差顯微鏡，透射電子顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡，酶標儀。

1.2 NB培養(yǎng)與鑒定 于2016年10月—2017年10月在石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科收集臨床確診腎結(jié)石且未應用藥物或手術(shù)治療患者的尿液，將5～10 ml尿液采用0.9%氯化鈉溶液稀釋2倍，高速離心機4 ℃離心40 min（14 000×g）；取管底2 ml混勻，以0.45 μm濾器過濾，再經(jīng)0.22 μm濾器加壓過濾。將1 ml濾液注入含約4 ml DMEM培養(yǎng)液、10% γ-胎牛血清和1% HEPES緩沖液的細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察NB生長，篩選出無污染的標本，用吸管吹打混勻后，吸入EP管。14 000×g，離心20 min，棄上清液，再加入無菌注射用水1.5 ml吹打混勻。重復上述步驟共計清洗NB 3次，采用納米細菌鈣染色（Von KOSSA法）和應用透射電子顯微鏡掃描（負染法）鑒定。

1.3 實驗分組 選取生長速度正常、光鏡下未見污染、呈路石樣形態(tài)的HK-2細胞，隨機分為5組：對照組（胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細胞），NB組（NB菌液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細胞），COM組（5 mmol/L COM懸液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細胞），nHAP組（300 mg/L nHAP、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細胞）和四環(huán)素干擾組（5 mg/L四環(huán)素、NB菌液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細胞）。

1.4 各組細胞蘇木素-伊紅（HE）染色觀察 分別于共同培養(yǎng)6、12、24 h后去除12孔板的爬片，PBS沖洗3次，95%乙醇溶液固定20 min，PBS沖洗3次，Harris蘇木素染1 min，自來水沖洗2 min，1%鹽酸乙醇分化5 s，伊紅染5 min；經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封固，于光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.5 各組細胞透射電子顯微鏡觀察 分別于共同培養(yǎng)12、24 h后提取各組細胞制成細胞懸液，離心后轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，PBS浸泡5 min后棄上清液；加入預冷的3%戊二醛固定2 h，PBS沖洗2次，3 min/次；再加入1%鋨酸固定2 h，PBS沖洗2次，3 min/次；梯度乙醇脫水，浸透、包埋后80 ℃聚合過夜。行超薄切片、染色。于透射電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6 細胞損傷因子指標檢測 分別于共同培養(yǎng)6、12、24 h后取各組細胞上清液，向吸盡培養(yǎng)液的細胞中加入0.25%胰蛋白酶并反復吹打?qū)⒓毎?，轉(zhuǎn)移至EP管中，分別加入PBS 400 μl。用超聲粉碎機粉碎，ATP酶試劑盒比色法檢測各組細胞Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性。按照試劑盒說明書分別檢測培養(yǎng)液中H2O2、MDA、LDH含量。

1.7 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測晶體滯留實驗 將HK-2細胞接種于鋪有清潔蓋玻片的12孔板內(nèi)，分別于共同培養(yǎng)6、12、24 h后取出各組樣本，加入COM懸液（每孔內(nèi)COM濃度200 mg/L），輕搖5～10 s，使COM晶體與底部細胞充分接觸。3 min后吸凈蓋玻片上方液體，加入飽和草酸鈉溶液漂洗3次。將蓋玻片從孔板中取出，4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗2次，5 min/次，搖床輕晃；加入5 mg/L的phalloidin-FITC 50 μl， 室 溫 避 光 孵 育 20 min；PBS沖 洗 2次，5 min/次；甘油封固。在488 nm和633 nm激發(fā)光下逐一觀察各組蓋玻片并進行圖像采集。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 各組細胞形態(tài)HE染色結(jié)果（×200）Figure1 HE staining of HK-2 cells in each group

2 結(jié)果

2.1 各組細胞HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示：對照組細胞形態(tài)大小均一，細胞核清晰、胞質(zhì)致密，未見明顯異常；NB組共同培養(yǎng)6 h后，可見部分細胞膨脹增大，細胞核松散，核膜模糊不清；COM組細胞腫脹，形態(tài)不規(guī)整，細胞數(shù)目明顯減少，細胞核松散，部分核膜溶解，核仁消失，隨著作用時間的延長，細胞損傷逐漸加重；nHAP組僅少量細胞腫脹，核膜較清晰，細胞核更加致密；四環(huán)素干擾組大部分細胞形態(tài)規(guī)則，致密，細胞核清晰，部分細胞出現(xiàn)胞體膨脹，細胞核松散（見圖1，本文彩圖見本刊官網(wǎng)：www.chinagp.net相關(guān)文章）。

2.2 各組細胞透射電子顯微鏡觀察結(jié)果 實驗過程中，對照組細胞膜結(jié)構(gòu)完整正常，膜外微絨毛數(shù)量豐富、規(guī)則；核膜結(jié)構(gòu)正常；線粒體形態(tài)正常及細胞亞顯微結(jié)構(gòu)正常（見圖2A、B、C和D）。

共同培養(yǎng)12 h后，NB組微絨毛結(jié)構(gòu)稍紊亂，局部絨毛消失；細胞核畸形，染色質(zhì)輕度分布不均，局部染色質(zhì)凝集；核外膜局部區(qū)域降解（見圖2E）；部分線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹；胞質(zhì)中偶見髓樣小體（見圖2F）。COM組細胞膜局部區(qū)域結(jié)構(gòu)紊亂，微絨毛分布不均，局部絨毛消失；細胞核染色質(zhì)邊集（見圖2I）；線粒體結(jié)構(gòu)腫脹；胞質(zhì)中見自噬小體。nHAP組細胞膜局部區(qū)域結(jié)構(gòu)破損，微絨毛結(jié)構(gòu)消失（見圖2M）；部分線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹；胞質(zhì)中見髓樣小體（見圖2N）。四環(huán)素干擾組細胞膜結(jié)構(gòu)完整，微絨毛結(jié)構(gòu)稍紊亂；細胞核畸形，染色質(zhì)輕度分布不均，局部染色質(zhì)凝集（見圖2Q）；核外膜局部區(qū)域降解；部分線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹；胞質(zhì)中偶見髓樣小體（見圖2R）。

共同培養(yǎng)24 h后，NB組細胞膜結(jié)構(gòu)破損，細胞核裸露在外；微絨毛基本消失（見圖2G），線粒體數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)腫脹，線粒體嵴模糊不清；胞質(zhì)中可見較多髓樣小體及自噬小體（見圖2H）。COM組細胞膜結(jié)構(gòu)破損，微絨毛分布紊亂，絨毛消失；核膜階段性溶解，結(jié)構(gòu)模糊不清；線粒體結(jié)構(gòu)腫脹，線粒體嵴模糊不清；胞質(zhì)中見髓樣小體及自噬小體（見圖2L）。nHAP組細胞膜結(jié)構(gòu)完整，核膜結(jié)構(gòu)正常；微絨毛分布不均，局部絨毛消失；細胞核染色質(zhì)邊集（見圖2O）；線粒體結(jié)構(gòu)腫脹，線粒體嵴模糊不清，局部區(qū)域降解；胞質(zhì)中偶見髓樣小體及自噬小體（見圖2P）。四環(huán)素干擾組細胞膜結(jié)構(gòu)完整，微絨毛基本消失；線粒體數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)腫脹，線粒體嵴模糊不清（見圖2S）。胞質(zhì)中可見較多髓樣小體及自噬小體（見圖2T）。

2.3 各組細胞損傷因子指標檢測結(jié)果 共同培養(yǎng)6 h后，各組細胞Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；共同培養(yǎng)12、24 h后，各組細胞Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中NB組和COM組共同培養(yǎng)12、24 h后Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性均低于對照組；nHAP組共同培養(yǎng)12 h后Na+/K+ATP酶活性低于對照組、高于COM組，Ca2+/Mg2+ATP酶活性低于對照組；共同培養(yǎng)24 h后Ca2+/Mg2+ATP酶活性低于對照組，高于NB組和COM組；四環(huán)素干擾素組共同培養(yǎng)12、24 h后Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性均高于NB組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

圖2 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果（A，C，E，G，I，K，M，O，Q，S：×1 700；B，D，F(xiàn)，H，J，L，N，P，R，T：×5 000）Figure2 Results of HK-2 cells in each group via transmission election microscope

共同培養(yǎng)6 h后，各組H2O2含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；共同培養(yǎng)12、24 h后，各組H2O2含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中NB組和COM組共同培養(yǎng)12、24 h后H2O2含量均高于對照組，nHAP組共同培養(yǎng)24 h后H2O2含量均低于NB組和COM組，四環(huán)素干擾組共同培養(yǎng)12、24 h后H2O2含量均低于NB組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。共同培養(yǎng)6、12、24 h后，各組MDA含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中NB組和COM組MDA含量均高于對照組，nHAP組MDA含量均低于NB組和COM組，四環(huán)素干擾組MDA含量均低于NB組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。共同培養(yǎng)6、12、24 h后，各組LDH含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中COM組LDH含量均高于對照組，nHAP組和四環(huán)素干擾組共同培養(yǎng)6 h后LDH含量均低于NB組和COM組，共同培養(yǎng)12、24 h后LDH含量均低于COM組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果 共同培養(yǎng)6 h后，NB組、COM組可觀察到少量晶體黏附，隨著共同培養(yǎng)時間延長，兩組細胞晶體黏附量進一步增加。共同培養(yǎng)6、12 h后，nHAP組未觀察到明顯的晶體黏附現(xiàn)象，共同培養(yǎng)24 h后，可觀察到少量晶體黏附。各時間點，四環(huán)素干擾組晶體黏附量均少于NB組（見圖3）。

表1 各組不同時間點Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性比較（s，n=3）Table1 Comparison of Na+/K+ ATPase and Ca2+/Mg2+ ATPase activity among each group at different times

表1 各組不同時間點Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性比較（s，n=3）Table1 Comparison of Na+/K+ ATPase and Ca2+/Mg2+ ATPase activity among each group at different times

注：與對照組比較，aP＜0.05；與NB組比較，bP＜0.05；與COM組比較，cP＜0.05；NB=納米細菌，COM=一水草酸鈣，nHAP=納米級羥基磷灰石

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表2 各組不同時間點培養(yǎng)液H2O2、MDA和LDH含量比較（s，n=3）Table2 Comparison of H2O2，MDA and LDH contents among each group at different times

表2 各組不同時間點培養(yǎng)液H2O2、MDA和LDH含量比較（s，n=3）Table2 Comparison of H2O2，MDA and LDH contents among each group at different times

注：與對照組比較，aP＜0.05；與NB組比較，bP＜0.05；與COM組比較，cP＜0.05；H2O2=過氧化氫，MDA=丙二醛，LDH=乳酸脫氫酶

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3 討論

泌尿系結(jié)石的病因復雜，其涉及遺傳、環(huán)境、生活膳食習慣等多種因素［9-11］。有文獻報道，含鈣結(jié)石占泌尿系結(jié)石的大多數(shù)，且約有23.7%的患者合并高鈣尿［12］。近年來，大量文獻報道了COM對動物腎小管上皮細胞的損傷作用，細胞膜損傷會促進細胞對晶體的黏附和聚集，晶體的聚集又會加重對細胞的損傷，從而使得晶體黏附和聚集進一步加強，促進了結(jié)石的形成［13-14］。李成文等［15］研究發(fā)現(xiàn)，將5 mmol/L COM晶體加入Wistar大鼠腎小管上皮細胞的培養(yǎng)液中8 h后，可以觀察到大量晶體黏附現(xiàn)象發(fā)生。因此，本研究將COM組（5 mmol/L）設為陽性對照組。

圖3 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞晶體黏附情況（×200）Figure3 The crystal adhering effect observed by laser scanning confocal microscope

ANSARI等［2］在30例腎結(jié)石患者中發(fā)現(xiàn)27例磷酸鹽結(jié)石患者感染NB，另外3例患者并未發(fā)現(xiàn)感染NB，NB的生物礦化能力可能與機體結(jié)石等鈣化相關(guān)疾病有關(guān)。ABROL等［4］指出NB在誘導鈣化和結(jié)石形成過程中起到了非常關(guān)鍵的作用。MARTEL等［16］認為NB廣泛存在于人體血液、尿液及組織器官中，NB可導致泌尿系結(jié)石形成。褚浩等［17］通過給大鼠一次性尾靜脈注射NB懸液，采用微計算機斷層掃描技術(shù)（Mirco CT）和病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)NB在第4周開始誘導大鼠腎臟形成結(jié)晶，說明NB可通過早期損傷腎臟誘導結(jié)晶形成。NB可形成磷酸鈣外殼，該外殼成分與nHAP相似。nHAP是一種與人體硬組織無機成分相類似的生物活性材料，在替代骨組織方面具有很大的應用潛力，但過高濃度的nHAP（200 mg/L以上）會對細胞DNA及大分子物質(zhì)造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，最終導致細胞凋亡［18］。本研究設置了高濃度nHAP組（300 mg/L）與NB組進行各項細胞損傷因子指標的比較。通過HE染色和透射電子顯微鏡對細胞進行形態(tài)學觀察，檢測ATP酶活性及培養(yǎng)液中LDH含量評估細胞膜損傷程度，檢測H2O2和MDA含量確定損傷過程中有無脂質(zhì)過氧化反應的參與。

本研究結(jié)果提示，COM對細胞膜的損傷較大，培養(yǎng)液中LDH含量升高和ATP酶活性降低說明細胞膜的完整性和連續(xù)性受到了較大影響；隨著COM作用時間的推移，胞質(zhì)中線粒體腫脹加重，細胞核逐漸溶解消失。NB和nHAP對細胞的損傷程度也隨著作用時間的延長而加重，但主要表現(xiàn)為刷狀緣排列紊亂，細胞膜則較完整。HE染色結(jié)果顯示，與nHAP組和四環(huán)素干擾組相比，在NB組細胞中觀察到了更多的胞體腫脹、核膜溶解、核仁消失等現(xiàn)象。通過透射電子顯微鏡觀察及細胞損傷因子指標檢測發(fā)現(xiàn)，nHAP在HK-2細胞中的分布密度比NB高，但對細胞的損傷程度卻低于NB。損傷HK-2細胞后，NB組中細胞晶體黏附程度遠高于nHAP組和四環(huán)素干擾組。綜合以上結(jié)果表明，NB對HK-2細胞的損傷程度及晶體滯留的影響遠大于nHAP，四環(huán)素可以抑制NB在這一過程中的作用，提示在損傷HK-2細胞及后續(xù)晶體黏附的過程中起主導作用的可能并非NB的磷酸鈣外殼，而是其菌體本身。

細胞損傷是引起結(jié)石的關(guān)鍵因素，腎小管上皮細胞損傷脫落后暴露的基底膜可以吸引結(jié)晶的黏附，而壞死的細胞碎片會進一步富集參與形成結(jié)石，從而導致腎結(jié)石的發(fā)生、發(fā)展［19-20］。HONG等［21］發(fā)現(xiàn)NB可以誘導HK-2細胞脂質(zhì)過氧化，導致HK-2細胞黏附COM晶體，進而損傷腎小管上皮細胞，這可能與腎結(jié)石的形成有關(guān)。有文獻報道，COM晶體通過誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)生大量活性氧自由基對腎小管上皮細胞造成損傷［22］。THAMILSELVAN等［23］將 LLC-PK1細胞置于500 g/L COM晶體條件下培養(yǎng)4 h后，觀察到培養(yǎng)液中LDH和MDA含量升高，而一定濃度范圍內(nèi)的抗氧化劑可以有效抑制脂質(zhì)過氧化反應，從而減少活性氧對細胞的損傷。本研究中，在COM和NB損傷細胞的過程中均伴有H2O2和MDA含量的升高，nHAP組中MDA和H2O2含量無明顯升高，四環(huán)素干擾組MDA和H2O2含量低于NB組，提示脂質(zhì)過氧化反應是NB損傷HK-2細胞的機制之一，且四環(huán)素可以抑制這一過程。

四環(huán)素是為數(shù)不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一，其可以穿透NB的鈣質(zhì)外殼從而發(fā)揮抗菌作用［19，24］。有文獻報道，四環(huán)素在治療NB相關(guān)的慢性前列腺、間質(zhì)性膀胱炎、牙周疾病和牙結(jié)石等方面均取得了不錯的效果［25-26］。HU等［5］通過尾靜脈注射NB建立大鼠腎結(jié)石模型，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素灌胃可以減少大鼠24 h尿LDH以及腎小管結(jié)晶數(shù)，推測四環(huán)素可能有抑制腎結(jié)石形成的作用。但目前為止，尚缺乏相關(guān)體外實驗的證據(jù)。本研究通過體外共同培養(yǎng)NB和HK-2細胞，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素可以抑制NB對HK-2細胞的損傷并減少損傷后的晶體滯留。進一步確認四環(huán)素在腎結(jié)石的預防和治療方面的有效性，對于該病在臨床上的診治具有積極的意義。

綜上所述，NB可能通過誘導脂質(zhì)氧化反應損傷HK-2細胞，損傷程度和晶體滯留程度與NB作用時間呈正比，四環(huán)素可以抑制這一過程。因此，NB可能通過以下途徑導致腎結(jié)石的形成：NB感染損傷腎小管上皮細胞后，晶體向暴露的基底膜黏附，與NB和壞死細胞碎片共同形成結(jié)石。因此運用四環(huán)素或其他抗菌藥物殺滅NB或者抑制脂質(zhì)過氧化反應可能是預防和治療結(jié)石的一個新的方向。

作者貢獻：王議鶴、吳雙、錢彪進行文章的構(gòu)思與設計：王議鶴、申茂磊進行研究的實施與可行性分析，撰寫論文，對文章整體負責，監(jiān)督管理；王議鶴、吳雙、申茂磊、褚浩負責數(shù)據(jù)收集；王議鶴進行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學處理、論文修訂；王議鶴、王勤章、褚浩、錢成、錢彪進行結(jié)果的分析與解釋；王勤章負責文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。