1例遺傳性遲發(fā)型耳聾大家系臨床特點(diǎn)及其基因檢測(cè)

楊立清，李 星，蘇雅拉圖，曹亞寧，白?；?*，吳柒柱*

(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 1.附屬醫(yī)院; 2.生命科學(xué)學(xué)院, 內(nèi)蒙古 通遼 028000)

耳聾是人類(lèi)感覺(jué)系統(tǒng)的缺陷，也是嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的常見(jiàn)疾病之一。耳聾病因主要有遺傳因素、環(huán)境因素和其他不明因素。其中遺傳因素最為主要，已有研究顯示，約50%～60%的耳聾患者為遺傳性耳聾[1]。遺傳方式主要包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X-連鎖等。遺傳因素所致的常染色體顯性遺傳性耳聾(autosomal dominantnon-syndromic sensorineural hearing loss, DFNA)大多數(shù)表現(xiàn)為語(yǔ)后的、遲發(fā)的和漸進(jìn)性的感音神經(jīng)性耳聾[2]。目前，已成功定位的DFNA基因位點(diǎn)排序到DFNA67，克隆成功的DFNA耳聾基因卻僅有30余個(gè)(http://hereditaryhearingloss.org.2017年)。本研究對(duì)1個(gè)遺傳性遲發(fā)型耳聾大家系進(jìn)行臨床表型及家系遺傳特征分析，并對(duì)常見(jiàn)耳聾基因及位點(diǎn)進(jìn)行初步篩查，進(jìn)一步為該類(lèi)疾病的早期篩查和診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 家系資料調(diào)查及樣本采集

該家系位于內(nèi)蒙古西部區(qū)，已傳6代，可追溯調(diào)查53人(圖1)，其中耳聾患者19例(12例男性，7例女性患者)。本研究中受試者為包括先證者在內(nèi)的13例，其中耳聾患者為7例，聽(tīng)力正常者為6人。對(duì)于該項(xiàng)目的倫理論證由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可，在所有受調(diào)查者均簽署知情同意書(shū)后，本項(xiàng)目組對(duì)該家系進(jìn)行了病史采集、聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)、全身體格檢查和生活習(xí)慣調(diào)查等，并抽取外周血10 mL于兩個(gè)EDTA抗凝管中保存于內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙古人基因組與遺傳病研究所。

1.2 方法

1.2.1 臨床聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)：本研究中對(duì)家系成員的純音測(cè)聽(tīng)檢查應(yīng)用了Madsen 502便攜式聽(tīng)力計(jì)(丹麥Madsen公司)及EAR- 3A插入式耳機(jī)(美國(guó)Aearo公司)，從而初步了解該家系的聽(tīng)力情況及病變性質(zhì)。應(yīng)用Madsen 901(丹麥Madsen公司)聲導(dǎo)抗儀進(jìn)行鼓室導(dǎo)納圖及聲反射域的檢測(cè)，以協(xié)助了解中耳傳導(dǎo)情況及病變性質(zhì)。

1.2.2 耳聾表型的判斷標(biāo)準(zhǔn)：本研究所參照的耳聾表型分析判斷標(biāo)準(zhǔn)為2003年的《非綜合征型遺傳性耳聾家系遺傳及聽(tīng)力學(xué)描述術(shù)語(yǔ)建議案》，將聽(tīng)力損失按言語(yǔ)頻率(0.5～4 kHz)的平均聽(tīng)閾分級(jí)：正常(聽(tīng)閾<20 dB HL)、輕度(聽(tīng)閾為20～40 dB HL)、中度(聽(tīng)閾為41～70 dB HL)、重度(聽(tīng)閾為71～95 dB HL)和極重度(聽(tīng)閾>95 dB HL)[3]。依據(jù)聽(tīng)力損失的頻率分布特點(diǎn)，又分為高頻(2～8 kHz)、低頻(0.25～1 kHz)、中間頻率(1～2 kHz)及全頻(0.25～4 kHz)聽(tīng)力下降為主的聽(tīng)力損失[4]。

.propositus圖1 耳聾家系遺傳系譜圖Fig 1 Genetic pedigree of deafness family

1.2.3 基因檢測(cè)

1.2.3.1 先證者已知基因的捕獲測(cè)序：通過(guò)深圳華大臨床檢驗(yàn)中心的遺傳性耳聾基因GJB3、GJB2、SLC26A4等127個(gè)基因芯片捕獲高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)先證者進(jìn)行疾病具體基因檢測(cè)(表1)。

1.2.3.2 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序驗(yàn)證：將捕獲測(cè)序后得到的疑似致病基因突變位點(diǎn)測(cè)序驗(yàn)證，常規(guī)Sanger測(cè)序方法驗(yàn)證該位點(diǎn)在家系所有成員中與耳聾表型的共分離情況。待驗(yàn)證基因突變位點(diǎn)的擴(kuò)增引物序列如下:GJB3上游引物，5′-CTTCCCCATCT CCAACATCCG-3′；下游引物，5′-GCAATGTAGAAG TCCACGAT-3′。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件簡(jiǎn)述如下:95 ℃預(yù)變性10 min后，94 ℃變性45 s，57.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后再72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。由北京六合華大基因科技有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 家系表型特征

該家系耳聾患者(18～62歲)臨床表現(xiàn)均為遲發(fā)性聽(tīng)力下降，發(fā)病年齡在10～40歲，均有耳鳴病史，無(wú)前庭功能障礙，無(wú)耳毒性藥物接觸史，無(wú)噪聲接觸史，均無(wú)智力障礙。聽(tīng)力損失均表現(xiàn)為語(yǔ)后聾，聽(tīng)力損失程度隨年齡而加劇。聽(tīng)力檢測(cè)診斷為雙側(cè)對(duì)稱(chēng)性輕度至重度感音神經(jīng)性耳聾，聽(tīng)力曲線多為平坦型(圖2)。該家系每一代都有患者而且男女均發(fā)病，屬于常染色體顯性遺傳。

2.2 候選基因測(cè)序結(jié)果

先證者在候選127個(gè)已知基因中未發(fā)現(xiàn)致病性突變。結(jié)合疾病的發(fā)病率、位點(diǎn)在各數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率及受檢者臨床主述，檢出以下臨床意義未明位點(diǎn)，位點(diǎn)詳情：GJB3，c.400A>G，目前還沒(méi)有對(duì)此位點(diǎn)致病性的報(bào)道，在臨床上意義未明(表2)。此位點(diǎn)在人群中發(fā)生頻率極低，經(jīng) SIFT和Polyphen對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)，所得結(jié)果均為有害。

2.3 侯選基因驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)候選基因突變位點(diǎn)GJB3，c.400A>G，對(duì)目的片段PCR擴(kuò)增后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示13個(gè)樣本均得到了目的DNA片段(333 bp)，瓊脂糖凝膠電泳圖(圖3)。然后對(duì)PCR產(chǎn)物通過(guò)Sanger測(cè)序方法直接測(cè)序驗(yàn)證，通過(guò)先證者檢測(cè)捕獲臨床意義未明的潛在基因致病突變位點(diǎn)：GJB3，c.400A>G，在該家系中無(wú)共分離現(xiàn)象(圖4)。13名受試者測(cè)序結(jié)果為：7例耳聾患者中有3例發(fā)生此位點(diǎn)突變；6名聽(tīng)力正常者中有2人發(fā)生此位點(diǎn)突變。

表1 耳聾檢測(cè)基因Table 1 Deaf detection genes

A.V- 9 right ear; B.V- 9 left ear; C.V-6 right ear; D.V- 6 left ear圖2 受試者純音聽(tīng)力檢測(cè)圖Fig 2 Pure tone audiometry of subjects

表2 先證者遺傳性耳聾基因檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of genetic deafness gene detection in the proband

1～13.subjects圖3 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物Fig 3 2% agarosegel electrophoresis was used to detect PCR products

A.Ⅴ- 9 severe hearing loss has GJB3, c.400 A>G mutation; B.Ⅴ- 6 normal hearing without GJB3, c.400 A>G mutation; C.Ⅳ- 12 severe hearing loss without GJB3, c.400 A>G mutation; D.Ⅵ- 6 normal hearing has GJB3, c.400 A>G mutation

3 討論

遺傳性耳聾是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重的聽(tīng)力損傷。根據(jù)是否合并有其他系統(tǒng)或器官疾病，臨床上將遺傳性耳聾分為非綜合征型耳聾和綜合征型耳聾。在非綜合征性耳聾的致聾病因中遺傳因素所占比例較高，雙側(cè)聾遺傳性高于單側(cè)聾[5]。

GJB3基因的突變與染色體顯性或者隱性遺傳性非綜合征型耳聾有關(guān)。該基因突變主要與后天的高頻性聽(tīng)力下降有關(guān)，有發(fā)生遲發(fā)性聽(tīng)力損失的可能。目前對(duì)GJB3基因突變所致耳聾的系統(tǒng)性報(bào)道較少。1998 年GJB3基因被發(fā)現(xiàn)并命名，該基因位于1p33～p35，基因全長(zhǎng)4 057 bp(chr1:35247911-35251967)[6]。GJB3基因編碼有270個(gè)氨基酸的連接蛋白31(Cx31)[7]。同年，兩個(gè)和顯性遺傳高頻聽(tīng)力下降相關(guān)的GJB3突變被報(bào)道[8]。根據(jù)耳聾變異數(shù)據(jù)庫(kù)(http://deafnessvariationdatabase.com/)發(fā)現(xiàn)的主要突變類(lèi)型有c.94C>T，c.250G>A，c.421A>G，c.497A>G，c.529T>G，c.538C>T，c.547G>A，c.580G>A，c.667C>A。目前的研究發(fā)現(xiàn)，連接蛋白(Cxs)的突變和耳聾有關(guān)[9]。間隙連接蛋白Cx31可在相鄰細(xì)胞間形成間隙連接通道，從而介導(dǎo)小分子物質(zhì)的通訊[10]。間隙連接蛋白在耳蝸Corti氏器的K+循環(huán)通路中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由于GJB3基因的突變，直接導(dǎo)致其編碼的Cx31蛋白結(jié)構(gòu)改變，使此蛋白在細(xì)胞膜上丟失。間隙連接蛋白的丟失將會(huì)導(dǎo)致K+循環(huán)被破壞，Corti氏器局部K+濃度過(guò)高發(fā)生鉀中毒，以致耳聾[11]。

在本研究中，通過(guò)遺傳性耳聾基因GJB3、GJB2、SLC26A4等127個(gè)基因芯片捕獲技術(shù)對(duì)先證者進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)受檢者在檢測(cè)范圍內(nèi)存在已知致病性突變，卻發(fā)現(xiàn)先證者存在GJB3基因臨床意義未明的突變位點(diǎn)：c.400A>G。目前還沒(méi)有關(guān)于該位點(diǎn)致病性的報(bào)道。根據(jù)Cx31蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，推測(cè)這一突變的發(fā)生可以使Cx31蛋白的M3跨膜區(qū)134位的Ser被Gly取代，使得Cx31蛋白的結(jié)構(gòu)改變，以至于正常功能喪失，引發(fā)耳聾。并且跨膜區(qū)M3的結(jié)構(gòu)域保守度為95%[12]，此區(qū)域內(nèi)發(fā)生氨基酸殘基的錯(cuò)義突變后很有可能導(dǎo)致Cx31無(wú)法發(fā)揮其正常功能。所以，此基因位點(diǎn)突變很有可能是導(dǎo)致該家系成員耳聾的重要原因。但是，后續(xù)經(jīng)直接測(cè)序驗(yàn)證，此突變位點(diǎn)在該家系中無(wú)共分離現(xiàn)象，即從先證者檢測(cè)捕獲的GJB3，c.400A>G基因突變位點(diǎn)不能確定為該家系的致病突變，有待進(jìn)一步測(cè)序和功能研究。