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    鬼臼苦素對人結(jié)直腸癌HCT-15細(xì)胞增殖的影響

    2018-12-11 08:18:42周麗麗劉賽璇劉莎莎王瑞婷申興斌
    關(guān)鍵詞:苦素亞基培養(yǎng)箱

    周麗麗,劉賽璇,趙 楊,劉莎莎,王瑞婷,申興斌△

    (1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科,河北承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院)

    結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率和病死率均位居全部惡性腫瘤的第5位,嚴(yán)重威脅人類的健康。目前,結(jié)直腸癌的治療仍以手術(shù)和放化療為主,但傳統(tǒng)放化療藥物缺乏特異性,在殺傷惡性腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也可以殺傷正常組織細(xì)胞,后期可因毒副作用大嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此,對于結(jié)直腸癌的治療仍需要尋找新的行之有效的方法,尋求治療結(jié)直腸癌的相關(guān)靶向位點(diǎn)及藥物一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題。胰島素樣生長因子-Ⅰ受體(insulin-like growth factor-Ⅰ receptor,IGF-ⅠR)可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和代謝,參與腫瘤的進(jìn)程,已成為目前腫瘤治療的新靶點(diǎn)[1],進(jìn)而探尋安全、低毒、高效的IGF-ⅠR抑制劑引起了眾多研究者的關(guān)注。近年來研究發(fā)現(xiàn),鬼臼苦素是一種特異性的IGF-ⅠR酪氨酸激酶抑制劑,能有效阻斷IGF-ⅠR介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo),從而抑制腫瘤細(xì)胞生長并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,而正常細(xì)胞的生長不受影響[2]。有研究已證實(shí)[3-5],鬼臼苦素在多發(fā)性骨髓瘤、葡萄膜黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中顯示出具有抗腫瘤活性,但國內(nèi)尚未見有關(guān)鬼臼苦素對結(jié)直腸癌作用的研究報(bào)道。為此,本研究觀察了鬼臼苦素對人結(jié)直腸癌HCT-15細(xì)胞增殖的影響,以期為結(jié)直腸癌的臨床治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑和細(xì)胞:人結(jié)直腸癌HCT-15細(xì)胞株,購自南京科佰生物科技有限公司。RPMI 1640及胰酶,購自美國Gibco公司;無支原體胎牛血清,購自杭州四季青生物工程材料有限公司;PBS,購自北京索萊寶科技有限公司;鬼臼苦素(picropodophyllin,PPP),購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司;CCK-8,購自日本同仁化學(xué)研究所。

    1.1.2 主要儀器:二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),超凈工作臺(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司),倒置相差顯微鏡(德國Leica公司),全自動(dòng)酶標(biāo)儀ELX808(美國伯騰儀器有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將HCT-15細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3天傳代一次,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 CCK-8法檢測鬼臼苦素對HCT-15細(xì)胞的抑制率:收集對數(shù)生長期HCT-15細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為4×104/ml,均勻接種于96孔板,每孔100μl。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,棄掉原培養(yǎng)基,更換為含有鬼臼苦素濃度分別為0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L的RPMI 1640培養(yǎng)基,每孔200μl,同時(shí)設(shè)對照組(不加藥物)和空白組(只加RPMI 1640培養(yǎng)基),每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24h、48h、72h后每孔加入10μ l CCK-8,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h,在450nm波長處用酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度值(OD值),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算不同藥物濃度對腫瘤細(xì)胞的生長抑制率。抑制率(%)=(對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%,并計(jì)算IC50。

    1.2.3 HCT-15細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察:收集對數(shù)生長期HCT-15細(xì)胞,按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板,放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長匯合約60%時(shí),按1.2.2分別更換含不同濃度鬼臼苦素的RPMI 1640培養(yǎng)基,對照組不含藥物。鬼臼苦素作用48h后,在倒置顯微鏡下觀察各組HCT-15細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,統(tǒng)計(jì)分析采用析因方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 HCT-15細(xì)胞的抑制率 與對照組相比,不同濃度鬼臼苦素作用于HCT-15細(xì)胞24h、48h、72h,HCT-15細(xì)胞的抑制率均明顯升高(P<0.01,表1)。鬼臼苦素濃度在0.125μmol/L~2μmol/L范圍內(nèi),隨著鬼臼苦素濃度的增加和作用時(shí)間的延長,HCT-15細(xì)胞的抑制率逐漸增加,且呈劑量-時(shí)間依賴性;鬼臼苦素的濃度和作用時(shí)間之間有顯著的交互作用(見表2,圖1)。

    鬼臼苦素作用HCT-15細(xì)胞24h、48h、72h的IC50值分別為13.087μmol/L、0.377μmol/L、0.183μmol/L。

    表1 不同濃度鬼臼苦素作用不同時(shí)間HCT-15細(xì)胞的抑制率(±s,%)

    表1 不同濃度鬼臼苦素作用不同時(shí)間HCT-15細(xì)胞的抑制率(±s,%)

    與對照組比較:aP<0.01

    培養(yǎng)時(shí)間24h 48h 72h對照組 0 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00組別 鬼臼苦素濃度(μmol/L)實(shí)驗(yàn)組0.125 3.65±0.39a 31.85±1.46a 41.53±0.44a 0.25 4.91±0.46a 43.07±2.42a 56.49±0.65a 0.5 6.35±1.07a 50.79±1.93a 74.34±0.42a 1 9.51±1.48a 64.38±0.83a 88.73±0.83a 2 17.92±0.85a 82.63±1.19a 93.92±1.92a 4 22.52±1.72a 86.04±1.24a 96.22±0.48a

    表2 鬼臼苦素對HCT-15細(xì)胞濃度和時(shí)間主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)

    圖1 不同濃度鬼臼苦素作用不同時(shí)間對HCT-15細(xì)胞的抑制率

    2.2 HCT-15細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化 倒置顯微鏡下觀察,對照組HCT-15細(xì)胞貼壁良好呈島嶼狀生長,細(xì)胞之間連接緊密,透明度大、折光性好。鬼臼苦素作用于H C T-15細(xì)胞后,細(xì)胞失去原有狀態(tài),大小不一、皺縮甚或碎裂,細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿底部呈懸浮狀,折光性差,細(xì)胞間距變大,島嶼狀貼壁生長的細(xì)胞數(shù)目減少;并且鬼臼苦素濃度越大、作用時(shí)間越長,上述表現(xiàn)越明顯(圖2)。

    圖2 不同濃度鬼臼苦素作用48h后對HCT-15細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

    3 討論

    IGF-ⅠR是由兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基組成的酪氨酸激酶受體,兩個(gè)亞基由二硫鍵連接,α亞基位于細(xì)胞外,β亞基在受體被激活后將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)。當(dāng)配體,主要是IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ與IGF-ⅠR的α亞基結(jié)合時(shí),膜結(jié)合的β亞基胞內(nèi)部分酪氨酸殘基自動(dòng)磷酸化[6];隨后,激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K/AKT)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,從而介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、存活和分化[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[8],結(jié)直腸癌組織IGF-ⅠR蛋白的表達(dá)明顯高于腺瘤及正常結(jié)直腸黏膜,提示IGF-ⅠR可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)。因此,干擾IGF-ⅠR介導(dǎo)的信號通路可能是治療結(jié)直腸癌的另外一種選擇。

    鬼臼毒素是鬼臼類植物中木脂素類化合物的代表,最早發(fā)現(xiàn)于美洲鬼臼(足葉草)。20世紀(jì)40年代證實(shí)鬼臼毒素具有抗癌活性,但由于毒副作用大,限制了鬼臼毒素在臨床的直接應(yīng)用[9]。多年以來,為得到更加高效、低毒的鬼臼毒素類抗癌藥物,研究者們一直致力于對鬼臼毒素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造和修飾。鬼臼苦素是鬼臼毒素的同分異構(gòu)體,具有順式內(nèi)酯環(huán),對微管蛋白沒有抑制作用,故不具有細(xì)胞毒性。在一項(xiàng)國外進(jìn)行的臨床一期研究試驗(yàn)中,非小細(xì)胞肺癌患者采用鬼臼苦素治療7個(gè)月,能延緩癌癥患者的疾病進(jìn)展,并且非小細(xì)胞肺癌患者也對鬼臼苦素顯示出較好的耐受性[10]。此外,Vasilcanu等[11]也發(fā)現(xiàn),惡性腫瘤細(xì)胞對鬼臼苦素幾乎不產(chǎn)生耐藥性,而且鬼臼苦素還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對傳統(tǒng)化療藥物的敏感性。但鬼臼苦素對結(jié)直腸癌是否同樣有效有待證實(shí)。

    本研究發(fā)現(xiàn),鬼臼苦素可明顯抑制人結(jié)直腸癌HCT-15細(xì)胞的增殖生長,在0.125μmol/L~2μmol/L濃度范圍呈劑量-時(shí)間依賴性。鬼臼苦素濃度為2μmol/L作用48h、72h時(shí),HCT-15細(xì)胞的抑制率可高達(dá)82.63%、93.92%,具有顯著的抑制效果。倒置顯微鏡下也觀察到鬼臼苦素作用48h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,濃度越大細(xì)胞形態(tài)變化越明顯。但鬼臼苦素對人結(jié)直腸癌HCT-15細(xì)胞發(fā)揮這一抑制作用的具體機(jī)制尚不清楚,仍需進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)以深入研究。

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