不同產(chǎn)地北沙參多糖的性質(zhì)和生物活性研究

景永帥，張丹參，蘇蕾，張瑞娟，吳蘭芳，鄭玉光，*

（1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北石家莊050200）

北沙參為傘形科植物珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr.schmidt ex Miq.）的干燥根，其性甘，味微苦、微寒，是傳統(tǒng)的藥食同源物品，具有養(yǎng)陰清肺、益胃生津、調(diào)解免疫系統(tǒng)等功效[1-2]，主產(chǎn)于山東、河北、內(nèi)蒙及遼寧等地[3]。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，北沙參中含有苷類、多糖類、香豆素類等成分，其中多糖所占比例最大，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種生物活性[4-6]。

目前，對(duì)北沙參多糖（Glehnia littoralis polysaccharide，GLP）的研究主要集中于同一產(chǎn)地提取方法和含量測定方面[7-8]，對(duì)不同產(chǎn)地的理化性質(zhì)及生物活性的差異性報(bào)道較少。本研究以北沙參為原料，采用水提醇沉法對(duì)10個(gè)產(chǎn)地的北沙參多糖成分進(jìn)行提取，并對(duì)各多糖的理化性質(zhì)和生物活性進(jìn)行研究，旨在探清北沙參的產(chǎn)地差異性，并為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

1，1-二苯基-2-苦味基肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、α-葡萄糖苷酶、對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，PNPG）、藍(lán)葡聚糖、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖 T5000、T50000、T150000、T270000：上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)；無水乙醇、FeSO4、水楊酸、過氧化氫、混和磷酸鹽、無水碳酸鈉均為分析純。

表1 10個(gè)產(chǎn)地北沙參樣品信息Table 1 10 producing area sample of Glehnia littoralis

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2恒溫水浴鍋：江蘇金壇宏華儀器廠；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化株式會(huì)社；KS-300DE超聲波清洗器：昆山潔力美超聲儀器有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)：島津儀器制造有限公司；TGL-15B高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；NDJ-4旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)：上海標(biāo)卓科學(xué)儀器有限公司；S-100傅里葉變換紅外光譜儀：珀金埃爾默儀器有限公司；凝膠色譜柱、BSZ-100自動(dòng)部分收集器、BT-100B數(shù)顯恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 北沙參多糖的提取

分別取10個(gè)產(chǎn)地的北沙參，粉碎，過40目篩，用3倍體積的95%乙醇回流提取2次，殘?jiān)稍飩溆谩Ｈ?00 g北沙參殘?jiān)?，加?0倍體積的蒸餾水，恒溫水浴鍋回流 2 h，離心（8 000 r/min、4 min），收集上清液，過濾，減壓濃縮至小體積，用4倍體積的無水乙醇醇沉，靜置過夜，抽濾，干燥[9]，分別命名為GLP-1、GLP-2、GLP-3、GLP-4、GLP-5、GLP-6、GLP-7、GLP-8、GLP-9、GLP-10。

北沙參多糖提取率的測定：將制備的10組北沙參多糖精密稱重，計(jì)算其提取率，多糖提取率/%=多糖重量/北沙參干粉重量×100。

2.2 北沙參多糖的理化性質(zhì)

2.2.1 可溶性總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算10種北沙參多糖的可溶性總糖含量[10]。

2.2.2 黏度的測定

分別稱取1 200 mg10組北沙參多糖樣品，在室溫25℃條件下，不經(jīng)超聲波和任何輔助條件下溶于300mL蒸餾水中，配置成濃度為4.0 mg/mL的多糖溶液，用黏度計(jì)測定其黏度。

2.2.3 紫外-可見光譜分析

分別配制0.1 mg/mL的10組北沙參多糖溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)在200 nm～800 nm范圍內(nèi)掃描[11]。

2.2.4 紅外光譜分析

分別稱取1.0 mg的10組北沙參多糖樣品，與KBr粉末混勻后壓片，傅里葉變換紅外光譜儀在4000 cm-1～5 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描[12]。

2.2.5 凝膠滲透色譜法測定分子量分布

2.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分 別 稱 取 5.0 mg 標(biāo) 準(zhǔn) 葡 聚 糖 T5000、T50000、T150000、T270000，溶解于5.0 mL的去離子水中，分別上凝膠滲透色譜柱，以蒸餾水為洗脫液，調(diào)節(jié)凝膠滲透色譜柱流速，設(shè)置自動(dòng)部分收集器收集每管3.0 mL，用苯酚-硫酸法測定樣品出峰液分布。計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖出峰的洗脫體積Ve，利用已知分子量為200萬的藍(lán)葡聚糖確定凝膠柱的空體積Vo，利用無水葡萄糖確定凝膠色譜柱的總體積Vt。以有效分配系數(shù)縱坐標(biāo)，以lgMw（Mw為分子質(zhì)量，molecular weigh）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。有效分配系數(shù)由以下公式求得：有效分配系數(shù)=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）。

2.2.5.2 測定多糖分子量及其分布

分別準(zhǔn)確稱取10組北沙參多糖樣品5.0 mg，加入5.0 mL去離子水溶解。將溶解后的多糖溶液放入離心機(jī)離心處理，取離心后所得的上清液，過0.45 μm濾膜后上樣，以去離子水作為洗脫液，調(diào)節(jié)凝膠滲透色譜柱的流速，設(shè)置自動(dòng)部分收集器使其每管收集3.0 mL，之后將收集到的每管樣品溶液經(jīng)苯酚-硫酸法顯色，測定其吸光度，從而檢測出各多糖樣品的出峰液體積分布。根據(jù)所得的多糖樣品的出峰液體積數(shù)據(jù)，代入所求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，從而計(jì)算出各組多糖樣品的分子量及其分布[12]。

2.3 北沙參多糖的生物活性

2.3.1 抗氧化活性

10組北沙參多糖樣品清除DPPH自由基、羥基自由基的測定參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[13-14]。

2.3.2 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性

10組北沙參多糖樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[15]。

3 結(jié)果與討論

3.1 北沙參多糖的提取率、可溶性總糖含量和黏度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=12.967x+0.0858，R2=0.993 7。根據(jù)公式計(jì)算10組北沙參多糖樣品的可溶性總糖含量。10組北沙參多糖樣品的提取率、可溶性總糖含量和黏度見表2。

由表2可知，10個(gè)不同產(chǎn)地的北沙參多糖提取率在（13.20±0.07）%～（26.75±0.01）%，內(nèi)蒙錫林郭勒盟產(chǎn)北沙參GLP-8的提取率最高，為（26.75±0.01）%，安徽亳州產(chǎn)北沙參GLP-1的提取率最低，為（13.20±0.07）%。10種北沙參多糖的可溶性糖含量均在80%以上，內(nèi)蒙赤峰產(chǎn)北沙參GLP-10的可溶性總糖最高，為（89.10±0.10）%，河北保定產(chǎn)北沙參GLP-7的可溶性總糖含量最低，為（81.28±0.02）%。室溫25℃，濃度為4 mg/mL的各多糖樣品溶液，內(nèi)蒙赤峰產(chǎn)北沙參多糖 GLP-10 黏度最大，為（9.40±0.10）Pa·s，河北承德產(chǎn)北沙參 GLP-2 黏度最小，為（6.55±0.05）Pa·s。對(duì)可溶性總糖含量和黏度進(jìn)行相關(guān)性分析，見表3。

表2 10組北沙參多糖樣品的提取率、可溶性總糖含量和黏度Table 2 Extraction rate，sugar content and viscosity of polysaccharides from Glehnia littoralis

表3 可溶性總糖含量與黏度的相關(guān)性分析Table 3 Analysis of correlation between soluble total sugar content and viscosity

由表3可知相關(guān)性為0.853，屬于極強(qiáng)相關(guān)，P為0.002，具有強(qiáng)顯著性。說明多糖溶液的黏度和可溶性總糖含量成正相關(guān)。

3.2 北沙參多糖的理化性質(zhì)

3.2.1 紫外-可見光譜分析

10組北沙參多糖的紫外-可見光譜圖見圖2。

由圖2可知，在檢測范圍內(nèi)，10組北沙參多糖樣品均在260 nm～280 nm范圍內(nèi)無明顯吸收，說明各產(chǎn)地的北沙參多糖中均不含蛋白質(zhì)和核酸[16]，在整個(gè)研究體系中，可排除蛋白質(zhì)和核酸的影響。

圖2 10組北沙參多糖的紫外-可見光譜圖Fig.2 Ultraviolet and visible spectra of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides

3.2.2 紅外光譜分析

10組北沙參多糖的紅外光譜圖見圖3。

圖3 10組北沙參多糖的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides

由圖3可以看出10組北沙參多糖的峰值，由左向右分別為：3400cm-1為-OH伸縮振動(dòng)吸收峰，2 927 cm-1處為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1 640 cm-1處為-OH吸收峰，1 421 cm-1處為=CH2變形吸收峰，1 161 cm-1處為C-O吸收峰，1 082 cm-1處為醇羥基-OH振動(dòng)吸收峰，847 cm-1處為α-型糖苷鍵[17]。10組不同產(chǎn)地的北沙參多糖的吸收峰峰形與位置相似，均具有多糖的特征吸收峰。

3.2.3 分子量分布和大小

標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖 T5000、T50000、T150000、T270000經(jīng)凝膠滲透色譜柱后測得數(shù)據(jù)，以有效分配系數(shù)為縱坐標(biāo)，以lgMw為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.409 4x+2.321 2，其R2=0.998 77，表明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線模型較為精確，回歸效果和回歸擬合效果顯著。

將試驗(yàn)所得10組北沙參多糖樣品洗脫體積代入求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可求出10組多糖樣品中的多糖分子量分布及其大小，如圖4所示。

圖4 10組北沙參多糖樣品分子量分布Fig.4 Molecular weight distribution of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides

由圖4可知多糖經(jīng)凝膠滲透色譜柱后，有4個(gè)特征吸收峰，即10組北沙參多糖樣品均由4個(gè)不同分子量大小的多糖組分組成，但分子量之間有差別。

3.3 北沙參多糖的生物活性

3.3.1 清除DPPH自由基

10組北沙參多糖對(duì)DPPH自由基清除作用見圖5。

圖5 10組北沙參多糖對(duì)DPPH自由基清除作用Fig.5 Scavenging effect on DPPH radical of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides

由圖5可知，10組北沙參多糖樣品對(duì)DPPH自由基均有一定的清除作用，且呈濃度依賴性。通過比較IC50值，對(duì)照品VC和各北沙參多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用大小：VC（0.005 mg/mL）＞GLP-3（0.237 mg/mL）＞GLP-2（1.324 mg/mL）＞GLP-9（1.749 mg/mL）＞GLP-4（1.854 mg/mL）＞GLP-5 （1.868 mg/mL）＞GLP-7（3.015 mg/mL）＞GLP-6（3.439 mg/mL）＞GLP-10（4.350 mg/mL）＞GLP-1 （5.161 mg/mL）＞GLP-8（5.220 mg/mL）。由此可知，河北安國產(chǎn)GLP-3對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng)。

3.3.2 清除羥基自由基

10組北沙參多糖對(duì)羥基自由基清除作用見圖6。

圖6 10組北沙參多糖對(duì)羥基自由基清除作用Fig.6 Scavenging effect on hydroxyl radical of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides

由圖6可知，10組北沙參多糖樣品均對(duì)羥基自由基均有一定的清除作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性。對(duì)照品VC和各北沙參多糖對(duì)羥基自由基的清除作用大小（IC50值）依次為：VC（0.072 mg/mL）＞GLP-3（0.564 mg/mL）＞GLP-6（1.057 mg/mL）＞GLP-4（1.858 mg/mL）＞GLP-5（2.221 mg/mL）＞GLP-1（3.323 mg/mL）＞GLP-8（3.975 mg/mL）＞GLP-10（7.090 mg/mL）＞GLP-9（7.953 mg/mL）＞GLP-7（9.542 mg/mL）＞GLP-2（14.819 mg/mL）。由此可知，河北安國產(chǎn)GLP-3的清除羥基自由基作用最強(qiáng)。

3.3.3 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

10組北沙參多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖7。

圖7 10組北沙參多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.7 Inhibition on α-glucosidase of 10 groups of Glehnia littoralis polysaccharides

由圖7可知，10組北沙參多糖樣品均對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，隨著多糖濃度的升高，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力也不斷增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，抑制能力趨于穩(wěn)定。對(duì)比IC50值，對(duì)照品阿卡波糖和各北沙參多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力大小為：阿卡波糖（0.501 mg/mL）＞GLP-3（10.614 mg/mL）＞GLP-8（10.769 mg/mL）＞GLP-5（11.485 mg/mL）＞GLP-4（14.882 mg/mL）＞GLP-6 （18.092 mg/mL）＞GLP-2（20.850 mg/mL）＞GLP-7 （20.993 mg/mL）＞GLP-10（22.873 mg/mL）＞GLP-1 （25.331 mg/mL）＞GLP-9（264.266 mg/mL）。由此可知，河北安國產(chǎn)GLP-3對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力最強(qiáng)。

4 結(jié)論

本文通過對(duì)10個(gè)產(chǎn)地的北沙參的多糖進(jìn)行提取，對(duì)其提取率、理化性質(zhì)及生物活性進(jìn)行測定，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地北沙參多糖的提取率存在差異，內(nèi)蒙錫林郭勒盟產(chǎn)北沙參多糖GLP-8的提取率最高，為（26.75±0.01）%；可溶性總糖含量范圍為（81.28±0.02）%～（89.10±0.10）%，其中產(chǎn)地為內(nèi)蒙赤峰的北沙參多糖（GLP-10）最高；不同產(chǎn)地北沙參多糖具有相似的紫外、紅外光譜學(xué)性質(zhì)及分子量分布；產(chǎn)地為河北安國的北沙參多糖（GLP-3）對(duì)DPPH和羥基自由基的清除率以及對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，IC50值分別為0.237、0.564、10.614 mg/mL。不同產(chǎn)地北沙參多糖理化性質(zhì)及生物活性存在差異，分析原因可能與不同產(chǎn)地北沙參的栽培管理、采收季節(jié)、加工方式的不同有關(guān)。近年來，由于市場經(jīng)濟(jì)刺激，多數(shù)種植戶以及加工企業(yè)有搶收，或者以次充好的情況存在。在推廣規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)的同時(shí)，也不能忽視生長環(huán)境對(duì)北沙參多糖的影響。