UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)結(jié)合UNIFI篩查平臺(tái)快速分析補(bǔ)骨脂化學(xué)成分

丁玉婷，鄭竹宏，趙仁云，張 娜，孫玉杰，李劍豪，王景紅，羅 杰，賈珊珊，孫毅坤

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100102)

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleacoryifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，內(nèi)服可溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉，用于腎陽(yáng)不足、陽(yáng)痿遺精、遺尿尿頻、腰膝冷痛、腎虛作喘和五更泄瀉等；外用可消風(fēng)祛斑、治療白癜風(fēng)和斑禿。補(bǔ)骨脂主要含有香豆素類、黃酮類、萜酚類等化學(xué)成分，其中活性成分包括補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、異補(bǔ)骨脂查耳酮(補(bǔ)骨脂乙素)、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂酚、3-羥基補(bǔ)骨脂酚等[1]。香豆素類化學(xué)成分8-甲氧補(bǔ)骨脂素[2]、補(bǔ)骨脂素[3-4]、補(bǔ)骨脂定[5-8]等具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤等作用，其中補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定具有雌激素樣作用；黃酮類化學(xué)成分中異戊烯基黃酮類化合物[9]包括補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚[10]、異補(bǔ)骨脂查耳酮(補(bǔ)骨脂乙素)[11]、新補(bǔ)骨脂異黃酮[11]等，具有較強(qiáng)的抗菌、抑制骨質(zhì)疏松、治療哮喘、抗炎、抗癌、抗氧化等作用；萜酚類化學(xué)成分補(bǔ)骨脂酚[12-13]、3-羥基補(bǔ)骨脂酚[14]等具有降糖降血脂、抗炎抗菌、抗氧化保護(hù)肝細(xì)胞、抗抑郁、植物雌激素、對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性并抑制其增殖等多種藥理活性。

傳統(tǒng)的化合物鑒定方法為手動(dòng)提取色譜峰，并結(jié)合碎片離子、保留時(shí)間等信息對(duì)化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，且對(duì)研究人員知識(shí)儲(chǔ)備量要求較高[15]。超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MSE)聯(lián)用技術(shù)可對(duì)藥材中化學(xué)成分進(jìn)行快速分離和鑒定，具有高靈敏度、高分辨和強(qiáng)大的表征能力[16-17]，其采集所得數(shù)據(jù)包括低能通道和高能通道碎片信息，有利于化合物的迅速表征，可用于單味藥[18-19]和復(fù)方制劑[20-23]中化學(xué)成分的鑒定，中藥配伍[24]、中藥炮制[25-28]和代謝組學(xué)[29]研究，以及中藥質(zhì)量控制[30]等。

本實(shí)驗(yàn)擬采用UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)結(jié)合UNIFI篩查平臺(tái)對(duì)補(bǔ)骨脂提取物化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，建立補(bǔ)骨脂化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MSE快速分析方法，并總結(jié)UNIFI篩查平臺(tái)用于天然產(chǎn)物中化合物快速鑒定的策略。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

AcquityTM超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)SYNAPT G2-Si質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源；AE240型分析天平：瑞士Mettler公司產(chǎn)品；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

補(bǔ)骨脂：由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院提供，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院王景紅主任藥師鑒定為藥典規(guī)定藥材；新補(bǔ)骨脂異黃酮(批號(hào)：520053-201401)、補(bǔ)骨脂素(批號(hào)：110739-201617)標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；異補(bǔ)骨脂素(批號(hào)：Y18O8H46134)、補(bǔ)骨脂定(批號(hào)：ZN1112BC13)標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；所有標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%。

乙腈、甲醇和甲酸：購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑及超純水均為質(zhì)譜級(jí)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品溶液制備 精密稱取2.0 g補(bǔ)骨脂藥材，用20 mL 70%甲醇溶液超聲提取30 min(功率240 W，頻率25 kHz)，冷卻至室溫后，以12 000 r/min離心2次，每次10 min，取上清液即為樣品溶液。

1.3.2對(duì)照品溶液制備 稱取適量新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素與補(bǔ)骨脂定對(duì)照品，用甲醇溶解、搖勻，于4 ℃避光保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件 Acquity BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為乙睛；洗脫程序：0～4 min(1%～35%B)，4～12 min(35%～65%B)，12～13 min(65%～98%B)，13.1 min(1%B)；柱溫35 ℃；樣品室溫度4 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件 ESI離子源MSE正離子模式；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；脫溶劑氣流速600 L/h；錐孔氣體流速50 L/h；錐孔電壓40 V；毛細(xì)管電壓3.0 kV高能通道；碰撞電壓10～45 eV。MSE掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 200；掃描時(shí)間0.2 s。為確保精確的質(zhì)量測(cè)定，使用亮氨酸-腦啡肽作為外標(biāo)在數(shù)據(jù)收集期間進(jìn)行質(zhì)量校正，可產(chǎn)生碎片離子m/z556.2771[M+H]+。使用Mass Lynx V4.1和以中藥數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)的UNIFITM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析。

2 結(jié)果與討論

利用2.2節(jié)中建立的補(bǔ)骨脂UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合軟件的自動(dòng)匹配篩選功能，得到初步的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品和化合物裂解規(guī)律對(duì)軟件給出的可能存在的化合物列表進(jìn)行手動(dòng)鑒定，以排除假陽(yáng)性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)共鑒定出44種化合物，包括28種黃酮類化合物、10種香豆素類化合物、2種單萜類化合物、4種其他成分，其中12種成分為首次在補(bǔ)骨脂中發(fā)現(xiàn)。補(bǔ)骨脂提取物中的化合物信息列于附表1，結(jié)構(gòu)圖示于附圖1～5(因篇幅有限，附表與附圖請(qǐng)登錄www.jcmss.com.cn下載)。

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1色譜條件的優(yōu)化 首先對(duì)流動(dòng)相組成(甲醇-水、乙腈-水)進(jìn)行考察，結(jié)果表明，乙腈-水系統(tǒng)能夠產(chǎn)生更好的峰形和更低的背景噪聲，通過(guò)改變水相中甲酸的比例(0%、0.01%、0.1%、0.2%)，發(fā)現(xiàn)0.1%的甲酸水溶液具有更好的離子化效率，且可以改善峰的對(duì)稱性。同時(shí)對(duì)其他條件，如流速(0.2、0.3、0.4 mL/min)、柱溫(30、35、40 ℃)、進(jìn)樣體積(2、3、5 μL)均進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例及洗脫時(shí)間確定了洗脫梯度，最終的色譜條件見(jiàn)1.4.1節(jié)。

2.1.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化 以出峰數(shù)量、峰形、離子碎片信息為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察了包括離子化模式(正、負(fù))、毛細(xì)管電壓(2.3、2.5、3 kV)、錐孔電壓(30、40 V)、離子源溫度(80、100、120 ℃)、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流速(600、700、800 L/h)和高能通道碰撞電壓(10～20、20～30、30～45、45～60、10～45 V)等參數(shù)。最終確定的質(zhì)譜條件見(jiàn)1.4.2節(jié)。

正離子模式下，補(bǔ)骨脂的70%甲醇提取物的總離子流圖示于圖1。由圖可見(jiàn)，補(bǔ)骨脂提取物中的化學(xué)成分得到了良好分離。

圖1 正離子模式下，補(bǔ)骨脂提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of extracts of P. coryifolia in positive ion mode

2.2 已知化合物的鑒定

已知化合物的鑒定策略分為以下幾步[31]：1) 藥材數(shù)據(jù)庫(kù)的建立。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，使用ChemDraw軟件和Chemspider網(wǎng)站繪制或下載藥材中可能存在的化合物結(jié)構(gòu)式，并導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI中形成補(bǔ)骨脂藥材數(shù)據(jù)庫(kù)；2) 初步鑒定結(jié)果。通過(guò)設(shè)置參數(shù)，利用UNIFI軟件自動(dòng)篩查、鑒定，并設(shè)置過(guò)濾器對(duì)結(jié)果進(jìn)行簡(jiǎn)單的人工篩選，過(guò)濾掉響應(yīng)值小于10 000，精確質(zhì)量數(shù)誤差大于10-5的數(shù)據(jù)，得到初步的化合物鑒定結(jié)果；3) 人工識(shí)別和鑒定。結(jié)合各化合物的特征離子精確質(zhì)量數(shù)、相對(duì)保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量、分子式、對(duì)照品信息及文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，得到最終結(jié)果。

2.2.1黃酮類化合物的鑒定 黃酮類化合物主要分為黃酮類和查耳酮類2種母核結(jié)構(gòu)，其可能的裂解途徑為丟失羰基和RDA裂解[32-33]，具體裂解規(guī)律示于圖2、圖3。黃酮類母核主要生成m/z137.023 2特征碎片離子，查耳酮母核主要生成m/z147.043 7和m/z119.049 1特征碎片離子，由此可快速鑒別2種黃酮類化合物。本實(shí)驗(yàn)共鑒定出28種黃酮類化合物，以峰26、39、43、8和40為例，分別分析其鑒定過(guò)程。

圖2 黃酮類化合物可能的裂解途徑Fig.2 Characteristic fragmentation pathway of flavonoids

圖3 查耳酮類化合物可能的裂解途徑Fig.3 Characteristic fragmentation pathway of chalcones

(1) 黃酮母核類

峰26化合物的母離子為m/z323.128 7[M+H]+，分子式為C20H18O4。由于其含有黃酮母核特征離子m/z137.026 0[M+H-C13H14O]+，推測(cè)其為黃酮類化合物。峰26的高能離子通道質(zhì)譜圖和裂解途徑示于圖4，其高能通道質(zhì)譜的碎片離子m/z267.067 7[M+H-C4H8]+、m/z239.073 2[M+H-C5H8O]+等與文獻(xiàn)報(bào)道[19,24-25]一致，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的碎片信息及保留時(shí)間信息比對(duì)，推測(cè)峰26為新補(bǔ)骨脂異黃酮。

圖4 正離子模式下，峰26的高能離子通道質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)Fig.4 MS spectrum in high energy scan (a) and fragmentation pathway (b) of peak 26 in positive ion mode

峰39的低能通道質(zhì)譜圖顯示其母離子為m/z391.191 7[M+H]+，分子式為C25H26O4。高能離子通道質(zhì)譜圖和裂解途徑示于圖5，碎片離子m/z267.067 7[M+H-C9H16]+、m/z239.066 5[M+H-C9H16-CO]+、m/z255.064 9[M+H-C10H16]+、m/z137.020 6[M+H-C18H22O]+、m/z335.127 1[M+H-C4H8]+與文獻(xiàn)中[19,24-25]Corylifol A的碎片信息一致，因此推測(cè)該化合物為Corylifol A。

峰43的低能離子通道質(zhì)譜圖顯示其母離子為m/z411.155 1[M+Na]+、m/z389.173 6[M+H]+，計(jì)算得出化合物的分子式為C25H24O4。峰43的高能離子通道質(zhì)譜圖和裂解途徑示于圖6，其中含有碎片離子m/z137.026 0[M+H-C18H20O]+和與其互補(bǔ)的碎片離子m/z183.084 6[M+H-C5H8-137.026 0]+，表明峰43為黃酮類化合物，且黃酮母核A環(huán)上只有1個(gè)羥基。質(zhì)譜圖中出現(xiàn)碎片離子m/z321.115 2[M+H-C5H8]+、m/z305.084 7[M+H-C6H12]+，與補(bǔ)骨脂異黃酮特征碎片離子m/z321.112 1[M+H]+、m/z305.080 5[M+H-CH4]+，表明峰43化合物比補(bǔ)骨脂異黃酮多1個(gè)C5H8，推測(cè)峰43為新補(bǔ)骨脂寧。

(2) 查耳酮母核類

峰8的低能離子通道質(zhì)譜圖顯示其母離子為m/z357.131 3[M+H]+，該化合物的分子式為C20H20O6，高能離子通道質(zhì)譜圖和裂解途徑示于圖7。圖中可見(jiàn)查耳酮母核特征離子m/z147.046 4[M+H-C5H10O2-C6H4O2]+和m/z119.049 0[M+H-C5H10O2-C6H4O2-CO]+，根據(jù)軟件匹配結(jié)果，推測(cè)其為查耳酮類化合物Brosimacutin G。

圖5 正離子模式下，峰39的高能離子通道質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)Fig.5 MS spectrum in high energy scan (a) and fragmentation pathway (b) of peak 39 in positive ion mode

峰40的母離子為m/z323.127 1[M+H]+，分子式為C20H18O4。高能離子通道質(zhì)譜圖和裂解途徑示于圖8，圖中出現(xiàn)查耳酮母核特征離子m/z147.041 1[M+H-C10H12O-CO]+和m/z119.053 8[M+H-C10H12O]+，推測(cè)為查耳酮類化合物。根據(jù)軟件匹配結(jié)果，推測(cè)峰40為補(bǔ)骨脂色烯查耳酮或異補(bǔ)骨脂色烯查耳酮。

2.2.2香豆素類化合物的鑒定 以呋喃香豆素為例，香豆素類化合物可能的裂解途徑示于圖9，主要為丟失取代基后再連續(xù)丟失羰基[36-37]。本實(shí)驗(yàn)共鑒定出10種香豆素類化合物，以峰4、5、7、13、14和31為例，分別分析其鑒定過(guò)程。

峰4、峰5的母離子分別為m/z389.084 0[M+Na]+、m/z389.083 8[M+Na]+，二者的分子式均為C17H18O9，保留時(shí)間分別為2.59、2.64 min，初步推測(cè)二者互為同分異構(gòu)體。峰4與峰5存在共同碎片離子m/z205.050 8(205.048 8)[M+H-C6H10O5]+，表明結(jié)構(gòu)中均含有葡萄糖基，共有特征碎片離子m/z159.046 1(m/z159.043 8)與m/z131.051 5(m/z131.049 1)表明苷元結(jié)構(gòu)為呋喃香豆素類化合物。以峰4為例，其高能離子通道質(zhì)譜圖和裂解途徑示于圖10，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[38-40]，推測(cè)峰4、峰5分別為補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷。

圖6 正離子模式下，峰43的高能離子通道質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)Fig.6 MS spectrum in high energy scan (a) and fragmentation pathway (b) of peak 43 in positive ion mode

圖7 正離子模式下，峰8的高能離子通道質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)Fig.7 MS spectrum in high energy scan (a) and fragmentation pathway (b) of peak 8 in positive ion mode

圖8 正離子模式下，峰40的高能離子通道質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)Fig.8 MS spectrum in high energy scan (a) and fragmentation pathway (b) of peak 40 in positive ion mode

圖9 香豆素類化合物可能的裂解途徑Fig.9 Characteristic fragmentation pathway of coumarins

圖10 正離子模式下，峰4的高能離子通道質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)Fig.10 MS spectrum in high energy scan (a) and fragmentation pathway (b) of peak 4 in positive ion mode

峰7、峰13、峰14含有相同的母離子m/z187.039 7[M+H]+，分子式為C11H6O3，其高能離子通道特征碎片離子均包括m/z115.057 6[M+H-CO-CO2]+、m/z131.051 5[M+H-2CO]+、m/z143.050 1[M+H-CO2]+、m/z159.046 1[M+H-CO]+，與文獻(xiàn)[38-40]報(bào)道的呋喃香豆素類化合物的特征碎片離子一致，初步推測(cè)為補(bǔ)骨脂呋喃香豆精、補(bǔ)骨脂素或異補(bǔ)骨脂素。以峰13為例，其高能離子通道質(zhì)譜圖和裂解途徑示于圖11。峰7、峰13、峰14的保留時(shí)間分別為3.54、4.50、4.65 min，補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素極性相近，略大于異補(bǔ)骨脂素[38-40]，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比對(duì)，可確定峰13為補(bǔ)骨脂素，峰14為異補(bǔ)骨脂素，峰7為補(bǔ)骨脂呋喃香豆精。

峰31的高能離子通道質(zhì)譜圖和裂解途徑示于圖12，母離子為m/z337.106 0[M+H]+，分子式為C20H16O5，高能通道質(zhì)譜中含有碎片離子m/z281.045 4[M+H-C4H8]+，表明其含有異戊烯基，m/z253.050 4[M+H-C4H8-CO]+為補(bǔ)骨脂定的特征碎片離子[35]。通過(guò)與補(bǔ)骨脂定標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)保留時(shí)間，確定峰31為補(bǔ)骨脂定。

2.2.3萜酚類化合物的鑒定 峰36、峰44的母離子分別為m/z255.173 9[M+H]+、m/z257.190 5[M+H]+，分子式為C18H22O和C18H24O。峰44的高能離子通道質(zhì)譜圖和裂解途徑示于圖13，含有碎片離子m/z201.130 9[M+H-C4H8]+、m/z187.111 4[M+H-C5H8]+，表明其含有異戊烯基。通過(guò)對(duì)比文獻(xiàn)[25,35]中保留時(shí)間等信息，確定該化合物為補(bǔ)骨脂酚。峰36的碎片離子m/z199.109 3[M+H-C4H8]+、m/z185.095 5[M+H-C5H8]+分別比峰44的碎片離子m/z201.130 9[M+H-C4H8]+、m/z187.111 4[M+H-C5H8]+少2個(gè)H，說(shuō)明其比補(bǔ)骨脂酚多1個(gè)雙鍵，推測(cè)該化合物為Delta(1),3-bakuchiol。

圖11 正離子模式下，峰13的高能離子通道質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)Fig.11 MS spectrum in high energy scan (a) and fragmentation pathway (b) of peak 13 in positive ion mode

圖12 正離子模式下，峰31的高能離子通道質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)Fig.12 MS spectrum in high energy scan (a) and fragmentation pathway (b) of peak 31 in positive ion mode

圖13 正離子模式下，峰44的高能離子通道質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)Fig.13 MS spectrum in high energy scan (a) and fragmentation pathway (b) of peak 44 in positive ion mode

2.3 未知化合物的鑒定

未知化合物的鑒定在已知化合物鑒定的基礎(chǔ)上進(jìn)行。分析UNIFI軟件中未匹配的高響應(yīng)值化合物信息，根據(jù)精確分子質(zhì)量、相對(duì)保留時(shí)間及高能通道的碎片信息，推測(cè)其可能的結(jié)構(gòu)。使用UNIFI軟件中Elucidate功能：1) 在Library Search中搜索本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，包括UNIFI自帶的中藥數(shù)據(jù)庫(kù)，得出匹配結(jié)果，并進(jìn)一步鑒定；2) 在ChemSpider Search中進(jìn)行在線數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得出匹配結(jié)果，并進(jìn)一步鑒定；3) 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索無(wú)結(jié)果的情況下，在Elemental Composition中根據(jù)可能的母離子和碎片離子精確質(zhì)量數(shù)計(jì)算得出可能的分子式，根據(jù)分子式及碎片離子的質(zhì)量數(shù)判斷化合物的結(jié)構(gòu)及含有的取代基。本實(shí)驗(yàn)鑒定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了12種未知化合物(峰1、2、10、11、20、23、24、30、32、35、37、42)，均為首次在補(bǔ)骨脂中發(fā)現(xiàn)。其中，推測(cè)出5種化合物(峰1、23、30、32、42)具體的分子結(jié)構(gòu)和7種化合物(峰2、10、11、20、27、35、37)可能的母核結(jié)構(gòu)。以峰11、23和35為例，分別分析其鑒定過(guò)程。

峰23的母離子為m/z355.145 6[M+H]+，其分子式為C21H22O5，高能離子通道質(zhì)譜圖和裂解途徑示于圖14。由圖可見(jiàn)，含有碎片離子m/z147.046 4[M+H-C12H16O3]+與m/z119.049 0[M+H-C12H16O3-CO]+，表明含有查耳酮結(jié)構(gòu)，m/z189.089 5[M+H-C9H7O2-H2O-H]+為母離子丟失1個(gè)羥基后，再發(fā)生RDA裂解丟失m/z147.046 4碎片生成。通過(guò)搜索本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，推測(cè)該化合物為Ashitaba-chlcone，為首次在補(bǔ)骨脂中發(fā)現(xiàn)。

圖14 正離子模式下，峰23的高能離子通道質(zhì)譜圖(a)及其裂解途徑(b)Fig.14 MS spectrum in high energy scan (a) and fragmentation pathway (b) of peak 23 in positive ion mode

圖15 正離子模式下，峰11的高能離子通道質(zhì)譜圖Fig.15 MS spectrum in high energy scan of peak 11 in positive ion mode

峰11的高能通道質(zhì)譜圖示于圖15，UNIFI軟件在補(bǔ)骨脂數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配結(jié)果為0，本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果也為0，因此采用手動(dòng)鑒定。首先通過(guò)Elucidate中Elemental Composition計(jì)算得出m/z1 075.575 2的分子式為C53H86O22，在ChemSpider search中以分子式為條件搜索得到64個(gè)結(jié)果，均為三萜皂苷類化合物，初步推測(cè)該化合物可能為三萜皂苷類化合物。三萜母核為苷元，母核上連接4個(gè)糖基。同時(shí)以高能通道的碎片離子精確質(zhì)量數(shù)m/z423.364 5為條件搜索ChemSpider search，發(fā)現(xiàn)該離子為三萜母核結(jié)構(gòu)。特征碎片離子m/z929.519 8[M+H-C6H10O5]+為丟失1個(gè)鼠李糖產(chǎn)生，m/z797.469 1[M+H-C6H10O5-C5H8O4]+為丟失1個(gè)鼠李糖后再丟失1個(gè)阿拉伯糖產(chǎn)生，m/z423.364 5[M+H-C6H10O5-C5H8O4-2C6H10O6-H2O]+為丟失1個(gè)鼠李糖、1個(gè)阿拉伯糖、2個(gè)葡萄糖的苷元結(jié)構(gòu)。因此，推測(cè)峰11為含有1個(gè)鼠李糖、1個(gè)阿拉伯糖、2個(gè)葡萄糖的三萜皂苷類化合物，其苷元結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

峰35的高能通道質(zhì)譜圖示于圖16，搜索本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)后，在TCM Chinese[UNIFI 1.7]數(shù)據(jù)庫(kù)中得到3個(gè)匹配結(jié)果，分別為L(zhǎng)upinifolin、桑皮酮S和5,7,4’-三羥基-8，3’-二異戊烯基黃酮，由其母離子m/z407.184 5[M+H]+

和m/z429.166 6[M+Na]+，計(jì)算得分子式為C25H26O5。高能通道質(zhì)譜圖含有碎片離子m/z137.022 8[M+H-C28H22O2]+，說(shuō)明含有黃酮母核結(jié)構(gòu)，且A環(huán)只有1個(gè)羥基，所以排除匹配到的結(jié)果，該化合物可能為潛在的新化合物。根據(jù)含有的碎片離子峰推測(cè)其可能含有的取代基：m/z389與m/z407相差18，推測(cè)其含1個(gè)羥基，經(jīng)計(jì)算得出[M+H-H2O]+精確質(zhì)量數(shù)為389.175 3，與碎片m/z389.173 9相符；m/z347與m/z389相差42，初步推算為[389-CO-CH2]或[389-3CH2]，經(jīng)計(jì)算得[389-3CH2]的精確質(zhì)量數(shù)為347.128 3，與碎片m/z347.126 7相符；其他碎片離子峰，如m/z333.114 4[M+H-H2O-C4H8]+、m/z319.092 2[M+H-H2O-5CH2]+、m/z279.064 0[M+H-H2O-C4H8-C4H6]+等的推導(dǎo)過(guò)程同上。綜上，推測(cè)峰35為B環(huán)上含有1個(gè)羥基和至少1個(gè)異戊烯基碳鏈的黃酮類化合物。

圖16 正離子模式下，峰35的高能離子通道質(zhì)譜圖Fig.16 MS spectrum in high energy scan of peak 35 in positive ion mode

2.4 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UNIFI數(shù)據(jù)篩查平臺(tái)功能強(qiáng)大，使用該軟件可顯著減少化合物鑒定過(guò)程中數(shù)據(jù)處理所耗時(shí)間，對(duì)黃酮類化合物匹配結(jié)果較好，而其他種類化合物假陽(yáng)性結(jié)果較多，分析過(guò)程中應(yīng)結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)品信息進(jìn)一步核實(shí)匹配結(jié)果。

化合物鑒定過(guò)程中存在大量的同分異構(gòu)體，應(yīng)根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)、碎片離子、保留時(shí)間等信息，結(jié)合已知化合物的質(zhì)譜信息推測(cè)未知化合物可能的結(jié)構(gòu)。部分化合物無(wú)特征離子碎片，無(wú)法準(zhǔn)確確定其母核結(jié)構(gòu)，需通過(guò)分析標(biāo)準(zhǔn)品總結(jié)母核裂解規(guī)律，在此基礎(chǔ)上推測(cè)取代基位置。如峰24、28、34、37母離子相同，分子式均為C20H20O4，與其他峰相比，峰28的高能通道質(zhì)譜中含有查耳酮類母核結(jié)構(gòu)的特征碎片離子m/z147.044 1和m/z119.049 0，推測(cè)峰28為補(bǔ)骨脂查耳酮或者異補(bǔ)骨脂查耳酮。峰34的碎片離子為m/z269.077 3[M+H-C4H8]+，表明其含有異戊烯基結(jié)構(gòu)，且碎片離子m/z167.084 1[M+H-C4H8-H2O-CH2=C=O-CH2=C=O]+、m/z149.022 3[M+H-C4H8-C8H8O]+、m/z147.043 8[M+H-C4H8-C7H6O2]+與文獻(xiàn)[35]中補(bǔ)骨脂二氫黃酮碎片相同，參考保留時(shí)間信息，推測(cè)峰34為補(bǔ)骨脂二氫黃酮。峰24與峰37的碎片離子幾乎相同，出現(xiàn)m/z269.081 0[M+H-C4H8]+，表明含有異戊烯基結(jié)構(gòu)，無(wú)黃酮及查耳酮的特征碎片離子，但其共同碎片離子m/z149.023 9[M+H-C4H8-C8H8O]+、m/z121.028 3[M+H-C4H8-C8H8O-CO]+比查耳酮特征碎片離子多2個(gè)H，推測(cè)其母核結(jié)構(gòu)為黃烷酮類，由碎片離子m/z131.012 8[M+H-C4H8-C8H8O-H2O]+、m/z93.033 8[M+H-C14H16O3]+推測(cè)二者為相同母核、相同取代基的同分異構(gòu)體，因取代基位置不同二者極性大小不同。目前，UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)無(wú)法區(qū)分取代基位置異構(gòu)體，需借用其他技術(shù)，如核磁共振氫譜儀，進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了補(bǔ)骨脂化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MSE快速分析方法，共鑒定出44種化合物，包括28種黃酮類、10種香豆素類、2種單萜類、4種其他成分化合物，其中12種成分為首次在補(bǔ)骨脂中發(fā)現(xiàn)。該工作為進(jìn)一步研究補(bǔ)骨脂的質(zhì)量控制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理作用等奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，總結(jié)了UNIFI篩查平臺(tái)快速鑒定已知和未知化合物的策略，可為化合物鑒定提供參考。