基于質(zhì)譜技術(shù)的黃芩治療2型糖尿病的糞便代謝組學研究

周 元，張沐新，張亞楠，劉志強，宋鳳瑞，趙春芳

(1.吉林大學藥學院，吉林 長春 130021；2.中國科學院長春應(yīng)用化學研究所，吉林 長春 130022)

糖尿病是由胰島素分泌缺乏或胰島素生物效應(yīng)降低引起的以血糖水平增高為特征的代謝性疾病[1-4]。臨床上以2型糖尿病患者最多，占總患病人數(shù)的90%以上[5-6]。中藥對改善機體狀況、減輕發(fā)病癥狀，尤其在治療糖尿病并發(fā)癥方面有著穩(wěn)定的療效[7-8]。黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabailensisGeorgi)的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效[9]，其主要活性成分為黃酮類化合物，如黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素[10-11]。有研究表明[12-13]，黃芩具有調(diào)節(jié)血糖、血脂以及抗氧化等作用。但關(guān)于黃芩治療2型糖尿病的整體作用機制尚無報道。

代謝組學以生物體內(nèi)源性代謝物小分子作為研究對象，通過多指標綜合分析，研究代謝物種類含量變化規(guī)律，以此揭示生物體的代謝活動[14-15]。目前，代謝組學發(fā)展迅速，并廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、藥物治療和毒性評價等領(lǐng)域[16]。以糞便為檢測對象的代謝組學研究常見于有關(guān)肝臟、腸道等疾病研究[17-18]，用以觀測肝臟及腸道參與的機體代謝變化。糖尿病作為一種長期代謝性疾病，其肝臟病變及腸道菌群變化也常見報道[19-20]。

本研究擬應(yīng)用糞便代謝組學研究方法，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF MS)分別檢測健康對照組、2型糖尿病模型組和黃芩治療組的大鼠糞便，并通過主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)尋找與黃芩治療作用相關(guān)的潛在生物標志物，通過分析這些生物標志物含量的變化，探索黃芩治療2型糖尿病的作用機制。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Acquity UPLC液相色譜儀、Q-TOF Synapt G2 HDMS 質(zhì)譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；Centrifuge 5810R 型冷凍離心機：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Milli-Q Gradient A10超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品。

黃芩：購于同仁堂長春分店，由長春中醫(yī)藥大學藥學院鑒定；鏈脲佐菌素：美國Sigma公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇：色譜純，美國Tedia公司產(chǎn)品。

1.2 黃芩提取物的制備

稱取適量的黃芩藥材粗粉，以8倍量60%乙醇加熱回流提取2次，合并提取液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后凍干，得到黃芩提取物粉末，備用。

1.3 疾病模型建立與藥物治療

1.3.1建模準備 選擇50只雄性SD大鼠，初始質(zhì)量為200～240 g，由吉林大學實驗動物中心提供。將鏈脲佐菌素溶液溶于pH 4.5的0.1%檸檬酸緩沖液中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

脂肪乳的配制：取40 g豬油、5 g膽固醇、1 g甲基硫氧嘧啶、40 mL吐溫80，充分混勻后得到油相。以1 g谷氨酸鈉、5 g蔗糖、5 g果糖、60 mL蒸餾水、60 mL 1,2-丙二醇，充分溶解混勻得到水相。將油相與水相充分混合，即得脂肪乳，于4 ℃冰箱中保存，使用時加熱溶解。

1.3.2建模方法 對大鼠脂肪乳連續(xù)灌胃20 天，灌胃劑量為0.1 mL/kg，然后以35 mg/kg的劑量腹腔注射新配的鏈脲佐菌素溶液。一周后，剪尾取血測定大鼠血糖值(檢測前禁食過夜)，大于16.7 mmol/L則建模成功。取15只建模成功大鼠，標準飼料喂養(yǎng)12周，為糖尿病模型組(模型組，TM)。另取15只建模成功大鼠，以3 g/kg黃芩提取物給藥量給藥12周，為黃芩治療組(黃芩組，RS)。健康對照組(HC)為正常大鼠，標準飼料喂養(yǎng)12 周，共15只。

1.4 樣品收集及制備

實驗第12周時，收集各組大鼠糞便，加入3倍量甲醇溶液，渦旋混勻5 min后，以5 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm 有機濾膜，待UPLC-Q-TOF MS檢測。

1.5 實驗條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；色譜柱溫度：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫條件：0～1 min(5%～30%A)，1～3 min(30%～50%A)，3～3.6 min(50%～53%A)，3.6～4.2 min(53%～60%A)，4.2～6 min(60%～80%A)，6～8 min(80%～100%A)，8～9 min(100%A)。

1.5.2質(zhì)譜條件 電噴霧(ESI)離子源；離子源溫度120 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000；錐孔氣和去溶劑氣均為氮氣，流速分別為50 L/h和700 L/h，其中去溶劑氣溫度為350 ℃。正離子模式下毛細管電壓為3.0 kV，負離子模式下毛細管電壓為2.0 kV；正、負離子模式下錐孔電壓和提取錐孔電壓均分別為40 V和5.0 V。利用甲酸鈉建立質(zhì)量標準曲線，亮氨酸腦啡肽(LE)進行實時質(zhì)量校正；以氬氣作為碰撞氣進行MS/MS分析，低碰撞能為5 eV，高碰撞能為10～25 eV。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用UPLC-Q-TOF MS 檢測樣品，將原始數(shù)據(jù)以 MassLynx V4.1 和 MarkerLynx Application Manager進行峰檢測、峰對齊、峰強度校正等，并將結(jié)果以精確分子質(zhì)量、保留時間、歸一化后的峰面積建立數(shù)據(jù)矩陣。使用EZinfo 2.0軟件中的PCA和OPLS-DA對數(shù)據(jù)矩陣進行多元變量分析。使用PASW Statistics 18.0軟件進行t檢驗，通過變量重要性因子(VIP)比較組間差異。并通過檢索HMDB(http:∥www.hmdb.ca/)，KEGG(http:∥www.kegg.com/)等生物學數(shù)據(jù)庫鑒定生物標志物，分析生物標志物在各組中的含量。

1.7 體重與空腹血糖檢測

分別在給藥之前(0周)，給藥第4、8、12周后對糖尿病模型組、黃芩治療組和健康對照組大鼠進行剪尾取血測血糖(檢測血糖前禁食過夜)，并稱量大鼠質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 體重與空腹血糖檢測結(jié)果

體重與空腹血糖是觀測糖尿病患者身體狀況的基礎(chǔ)指標，二者隨時間變化的結(jié)果分別列于表1、表2。在治療的12周過程中，黃芩組大鼠體重下滑趨勢相比模型組較為緩慢，第12周兩組大鼠的體重呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

表1 各組大鼠體重(平均值±SD，n=8)Table 1 Weight of rats in each group (Means±SD, n=8)

注：*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01

表2 各組大鼠血糖(平均值±SD，n=8)Table 2 Blood glucose of rats in each group (Means±SD, n=8)

注：*表示與模型組相比P<0.05；**表示與模型組相比P<0.01

結(jié)果表明，黃芩對2型糖尿病大鼠體重下降有一定抑制作用。血糖檢測結(jié)果與體重檢測結(jié)果類似，黃芩組大鼠空腹血糖增長趨勢相比模型組較為緩慢，第12周兩組大鼠的血糖呈顯著性差異(P<0.01)。綜上，體重和空腹血糖檢測結(jié)果表明，黃芩對于糖尿病大鼠的健康狀況有一定的改善作用，且隨著治療時間延長，作用更加明顯。

2.2 糞便代謝物譜分析及潛在生物標志物鑒定

處理后的糞便樣品經(jīng)UPLC-Q-TOF MS分離和檢測，結(jié)果導入MassLynx V4.1軟件，運用代謝組學方法進行分析。對數(shù)據(jù)進行PCA分析，正、負離子模式下的PCA得分圖示于圖1。PCA得分圖中每個點的位置代表某一樣品的成分和含量，點的位置越接近，樣品的成分含量越接近。圖1中，健康對照組、模型組和黃芩組的PCA得分點表現(xiàn)出明顯的區(qū)分，表明模型組和黃芩組的大鼠糞便代謝物圖譜相對于健康對照組有明顯的變化。

通過OPLS-DA分析法進一步區(qū)分模型組和黃芩治療組的組間差異。正、負離子模式下的OPLS-DA得分圖示于圖2。由圖可以看出，在兩種離子模式下，模型組和黃芩組均有明顯的區(qū)分，表明黃芩給藥12周后，2型糖尿病大鼠的糞便代謝有了明顯的改變。

注：■——健康對照組；◆——模型組；▲——黃芩組圖1 正(a)、負(b)離子模式下的PCA得分圖Fig.1 PCA score plots at positive (a) and negative (b) ion mode

通過分析OPLS-DA模型下的S-plot圖，尋找組間差異明顯的代謝物。正、負離子模式下的S-plot圖示于圖3。其中，“S”型圖形由每個代謝物點構(gòu)成，位于“S”兩端的點為區(qū)分模型組和黃芩組大鼠貢獻較大的代謝物。選擇VIP值大于1的代謝物，通過質(zhì)荷比和串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合搜索數(shù)據(jù)庫，共鑒定出11種化合物，即黃芩治療2型糖尿病大鼠的潛在生物標志物。

注：◆ ——模型組；▲—— 黃芩組圖2 正(a)、負(b)離子模式下的OPLS-DA得分圖Fig.2 OPLS-DA score plots at positive (a) and negative (b) ion mode

2.3 黃芩治療2型糖尿病作用機制分析

正、負離子模式下，11種生物標志物的基本信息及在各組中的含量變化列于表3，11種生物標志物在各組中的相對含量信息示于圖4。通過分析模型組與健康對照組的標志物含量的變化趨勢，以及黃芩組相對于模型組對標志物含量的調(diào)節(jié)作用，可闡明黃芩對各代謝通路的調(diào)節(jié)作用。

圖3 正(a)、負(b)離子模式下，模型組和黃芩組的S-plot圖Fig.3 S-plot of OPLS-DA at positive (a) and negative (b) ion mode

鞘氨醇、加鞘氨醇和植物鞘氨醇均與機體鞘脂類代謝通路有關(guān)，鞘脂類代謝產(chǎn)物通常為脂質(zhì)信號分子，可以影響細胞增殖、分化、凋亡等過程。有研究表明[21]，鞘脂類代謝異常與胰島素抵抗等多種慢性疾病密切相關(guān)。鞘氨醇是一種氨基醇，在體內(nèi)可以衍生形成加鞘氨醇。加鞘氨醇是一種磷脂，在體內(nèi)可以抑制膽固醇的運轉(zhuǎn)，并通過抑制低密度脂蛋白而抑制膽固醇酯化反應(yīng)。鞘氨醇和加鞘氨醇是哺乳動物鞘脂類的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。由表3可以看出，黃芩對于這3種生物標志物的含量調(diào)節(jié)作用均與疾病的惡化趨勢相反，說明黃芩對鞘脂類代謝通路具有調(diào)節(jié)作用。

表3 黃芩治療2型糖尿病的潛在生物標志物Table 3 Potential biomarkers of Radix Scutellariae treated for type 2 diabetes

圖4 生物標志物在健康組、模型組和黃芩組中相對含量圖(*表示與模型組相比，P<0.01)Fig.4 Relative intensities of biomarkers from HC, DM and RS (*P<0.01, compared to DM)

三羥基三甲基吲哚酮是三甲基吲哚代謝過程中形成的產(chǎn)物。色氨酸代謝形成三甲基吲哚后，由腸道細菌進一步氧化形成三羥基三甲基吲哚酮，因此，該化合物與色氨酸代謝通路相關(guān)。表3顯示，黃芩對該標志物的含量具有調(diào)節(jié)作用，說明黃芩可通過影響腸道菌群而影響色氨酸的代謝。

脂肪酸代謝異常與糖尿病密切相關(guān)[22]，苯丙酸甲酯、二十四酰基甘氨酸、亞麻油酸均是與脂肪酸代謝相關(guān)的生物標志物。苯丙酸甲酯是一種脂肪酸酯，是脂肪酸的羧酸酯衍生物，多存在于糞便中。二十四?；拾彼崾且环N常見的氨基乙酸，是脂肪酸的代謝產(chǎn)物，常與脂肪酸氧化功能障礙有關(guān)。亞麻油酸與脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)，位于亞麻油酸的代謝通路中。由表3可以看出，黃芩對這3種標志物均有正向調(diào)節(jié)作用，據(jù)此推斷黃芩對脂肪酸的代謝具有調(diào)節(jié)作用。

白三烯E4是一種半胱氨酰白三烯，是炎癥介質(zhì)家族中的一類化合物，位于花生四烯酸代謝通路中，白三烯E4水平的升高被認為與炎癥的發(fā)生有關(guān)。表3中顯示，模型組與健康對照組的白三烯E4水平升高，說明2型糖尿病會導致機體炎癥的發(fā)生，而黃芩治療組中白三烯E4水平下降，可見黃芩對機體炎癥的發(fā)生具有抑制作用。

亮氨酰脯氨酸屬于多肽類物質(zhì)，它由2個氨基酸結(jié)合衍生而成，在機體中常產(chǎn)生較大蛋白質(zhì)的降解。黃芩對于亮氨酰脯氨酸的含量變化具有調(diào)節(jié)作用。

雌二醇是一種雌激素類固醇，屬于內(nèi)源性抗氧化劑，具有抑制肝臟纖維化等功能。機體內(nèi)可由芳香化酶將睪酮轉(zhuǎn)化成雌二醇。雌二醇處于機體甾類激素生物合成途徑中，黃芩對雌二醇的含量具有正向調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)論

本研究采用基于UPLC-Q-TOF MS的糞便代謝組學方法，研究了黃芩治療2型糖尿病大鼠的糞便代謝譜變化，并監(jiān)測了大鼠體重及空腹血糖隨時間的變化情況。結(jié)果表明，黃芩對2型糖尿病大鼠的鞘脂類代謝及脂肪酸代謝具有治療作用，同時對于三羥基三甲基吲哚酮、白三烯E4、亮氨酰脯氨酸和雌二醇的含量具有調(diào)節(jié)作用，并且，黃芩對于大鼠體重的減少和空腹血糖的增加具有一定的控制作用。