具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)在δ13C和δ15N測定中的應用

孟憲菁，楊 斌，李 安，賈曉藝，朱 湘，馬 瀟，尹 松

(1.中國科學院西雙版納熱帶植物園，云南 勐侖 666303；2.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海 201206；3.北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究中心，北京 100097；4.三門峽市陜州區(qū)農(nóng)業(yè)畜牧局，河南 三門峽 472100；5.普洱學院，云南 普洱 665000)

基于快速燃燒的原理，連續(xù)流技術(shù)的元素分析-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀(EA-IRMS)在線聯(lián)機系統(tǒng)可以將固體或粘稠狀樣品中有機碳(C)、總氮(N)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的CO2和N2，實現(xiàn)了碳和氮的穩(wěn)定同位素組成(δ13C和δ15N)的高精度測量[1-3]。IRMS測定樣品氣體時，需要引入1個已知同位素值的參考氣體作對照[4]。為保證測定結(jié)果的可靠性，樣品氣與參考氣的質(zhì)譜信號強度要盡量接近[5]。由于自然界中樣品C、N元素含量和C/N的變化極大，并且不同元素的離子化效率存在較大差異，導致連續(xù)流進樣的信號強度變化范圍極大[1,3,6]。

以往技術(shù)人員通過嚴格控制取樣量，基于氦氣(He)進行固定比例的稀釋，從而使樣品氣與參考氣信號保持一致[5]。但是，該方法耗時、費力，有時甚至需要準確測定待測樣品的元素含量。具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)[7-8]可以將測試序列的每個樣品的信號強度通過He稀釋至參考氣信號水平[7]。對于同一測試序列中C/N差異較大的樣品，以及難以精確稱重的粘稠狀樣品(如蜂蜜、動物脂肪等)，該系統(tǒng)無需精確控制樣品質(zhì)量，可直接裝樣上機，大大提高了樣品的分析效率[8]。

可以預見，在δ13C和δ15N的測定上，具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS有一定的優(yōu)勢和應用前景[8]。然而，目前有關(guān)該聯(lián)機系統(tǒng)在樣品測量中的準確性和穩(wěn)定性考察還未見報道。本工作擬從以下幾個方面進行研究：1) 評價具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS與以往具有固定比例稀釋功能的EA-IRMS測定結(jié)果的一致性；2) 探討具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS對不同類型樣品δ13C和δ15N測定結(jié)果的重復性；3) 評價該聯(lián)機系統(tǒng)在不同測量時間上的再現(xiàn)性。希望為EA-IRMS技術(shù)的應用與發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器介紹

EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)主要由Flash 2000HT元素分析單元、ConFlo Ⅳ連續(xù)流接口裝置和DELTA ⅤAdvantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品)三部分組成。

Flash 2000 HT安裝了快速燃燒反應器和高溫轉(zhuǎn)化反應器[9]。其中，燃燒反應器將樣品在高溫和過氧環(huán)境下瞬間燃燒，經(jīng)銅(Cu)還原形成CO2、N2等氣體。然后通過除鹵、除硫劑(Ag2Co3O4)和干燥劑(Mg(ClO4)2)吸附燃燒產(chǎn)生的鹵素、SO2和H2O等氣體。純化的CO2和N2氣體經(jīng)恒溫氣相色譜柱分離后進入ConFlo Ⅳ，并由氦氣進行固定比例的稀釋。Flash 2000 HT還配有Smart EA動態(tài)稀釋組件，控制He流量對進入ConFloⅣ的樣品氣進行不同比例的稀釋[7]，主要參數(shù)設(shè)定列于表1。

表1 Flash 2000 HT元素分析儀的參數(shù)設(shè)定Table 1 Parameters of Flash 2000 HT Elemental Analyzer

ConFlo Ⅳ是具有自動稀釋功能的連續(xù)流通用接口，采用高純CO2(99.995%)和N2(99.999%)作為參考氣，并由高純He(99.999%)稀釋和運載。通過內(nèi)置的開口分流器將參考氣和樣品氣引入DELTA V Advantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀中，在樣品N2出峰之前、樣品CO2出峰之后分別引入?yún)⒖細狻?/p>

DELTA V Advantage是具有3 kV加速電壓的氣體穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀，在1.6×10-4Pa超高真空條件下，該儀器采集CO2氣體電離后產(chǎn)生的[12C16O2]+、[13C16O2]+和[12C16O18O]+分子離子束，或N2氣體電離后產(chǎn)生的[14N2]+、[14N15N]+和[15N2]+分子離子束，經(jīng)不同電阻值的放大器轉(zhuǎn)化為電壓信號后完成δ13C和δ15N的檢測。

1.2 實驗方法

為了評價不同稀釋方法對δ13C和δ15N測定結(jié)果的影響，分別采用不稀釋(0)、固定比例稀釋(57%)和動態(tài)稀釋(0～96%)的EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)對蜂蜜、豬肉脂肪、豬肉、雞肉、頭發(fā)、菠菜、土壤及咖啡因進行測定。這些樣品的C和N元素含量分別為0.24%～79%和0.078%～29.5%，其中，土壤樣品中C和N含量極低，所以取樣量較大。不稀釋時，上述8種樣品取樣量依次為(0.260±0.075)、(0.226±0.093)、(0.181±0.070)、(0.232±0.070)、(0.172±0.026)、(0.274±0.032)、(15.531±1.843)和(0.205±0.052) mg(n=3)；固定比例稀釋時，取樣量依次為(0.603±0.065)、(0.648±0.016)、(0.647±0.032)、(0.566±0.029)、(0.486±0.063)、(0.559±0.084)、(29.848±2.310)和(0.515±0.083) mg(n=3)；動態(tài)稀釋時，取樣量依次為(0.400±0.191)、(0.504±0.138)、(0.343±0.142)、(0.394±0.184)、(0.480±0.149)、(0.448±0.087)、(42.329±10.209)和(0.377±0.076) mg(n=3)。

為實現(xiàn)動態(tài)稀釋，需建立EA-IRMS中熱導檢測器(TCD)與質(zhì)譜檢測器(MSD)信號強度的相關(guān)關(guān)系。具體方法是：稱取不同質(zhì)量純尿素，得到TCD與MSD信號強度(ITCD和IMSD)之間的線性關(guān)系，即CO2：IMSD=1.4774×ITCD-834.49(r2=0.999 9)和N2：IMSD=1.042 6×ITCD-657.81(r2=0.999 8)；再將后續(xù)每個樣品的TCD信號代入上述方程得到原始的MSD信號，通過Isodat 3.0軟件計算稀釋比例[7]，將該MSD信號稀釋至參考氣信號水平(m/z44：6 V；m/z28：1.5 V)。動態(tài)稀釋EA-IRMS測定δ13C和δ15N的結(jié)果譜圖示于圖1。

注：1～3為N2參比峰；4為N2樣品峰；5為CO2樣品峰；6～8為CO2參比峰；9和10分別為TCD檢出的N2和CO2樣品峰圖1 動態(tài)稀釋EA-IRMS的質(zhì)譜檢測器MSD(a)和熱導檢測器TCD(b)測定δ13C和δ15N的色譜圖Fig.1 Chromatograms of δ13C and δ15N measured by MSD (a) and TCD (b) detectors of EA-IRMS equipped with dynamic dilution component

為探討具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS對不同類型樣品δ13C和δ15N測定結(jié)果的重復性，在同一個測試序列中對9種不同類型樣品(蜂蜜、豬肉脂肪、豬肉、雞肉、頭發(fā)、菠菜、蘋果、土壤及咖啡因)進行測定。各平行樣品之間設(shè)置一定的質(zhì)量梯度，取樣量依次為0.278～0.621、0.354～1.318、0.220～1.820、0.237～2.029、0.461～0.638、0.358～3.545、1.739～6.249、16.350～32.687和0.299～0.451 mg(n=3)。

為評價具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS在不同測量時間上的再現(xiàn)性，分別于2016年3月4日和4月19日采用該聯(lián)機系統(tǒng)對上述蜂蜜、豬肉脂肪、豬肉、雞肉、頭發(fā)、菠菜和土壤樣品的δ13C和δ15N進行分析。2次測定中，樣品取樣量與上述的δ13C和δ15N測定結(jié)果重復性測試接近。

1.3 數(shù)據(jù)分析

碳和氮的穩(wěn)定同位素組成采用相對于國際標準物質(zhì)(VPDB和AirN2)的千分差/‰，用符號δ表示，本文統(tǒng)一簡寫成δ13C和δ15N。所有被測樣品δ13C和δ15N均采取兩點線性內(nèi)插法[4]進行數(shù)據(jù)標準化，即采用2個不同δ13C和δ15N的標準物質(zhì)，建立其真值與測量值之間的線性方程，將被測樣品的測量值代入該方程后得到標準化的δ13C和δ15N。本研究的2個標準物質(zhì)分別為USGS40和USGS41，其化學成分均為L-谷氨酸，δ13C真值分別為-26.39‰和37.63‰，δ15N真值分別為-4.52‰和47.57‰。不同稀釋方法(不稀釋、固定比例稀釋和動態(tài)稀釋)對δ13C和δ15N測量結(jié)果的影響，以及具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS在不同時間對δ13C和δ15N測量結(jié)果的差異性均采用最小顯著性差異法(LSD)進行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同稀釋方法下δ13C和δ15N測定結(jié)果的一致性

不稀釋(0)、固定比例稀釋(57%)和動態(tài)稀釋(0～96%)下，不同類型樣品δ13C和δ15N的測定結(jié)果示于圖2。動態(tài)稀釋與固定比例稀釋、不稀釋相比，δ13C平均偏差分別為(-0.14±0.22)‰和(0.05±0.18)‰。動態(tài)稀釋與不稀釋相比，δ15N平均偏差為(0.02±0.24)‰。3種稀釋方法的δ13C和δ15N測定結(jié)果不存在顯著差異(p>0.05)。大部分樣品在不稀釋或稀釋后的MSD信號強度均大于1 V，受空白效應影響較??；δ13C和δ15N不存在顯著非線性問題[10-11]，這可能是不同稀釋方法的測定結(jié)果較一致的重要原因。δ13C和δ15N的測定結(jié)果表明，具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS能夠滿足實驗室測試要求[12-13]。尤其當不同樣品之間C、N元素含量及C/N差異很大或者難以精確稱重時，動態(tài)稀釋法更加實用且高效[8]。

圖2 不稀釋、固定比例稀釋與動態(tài)稀釋EA-IRMS測定δ13C(a)和δ15N(b)結(jié)果的一致性Fig.2 Consistency ofδ13C (a) and δ15N (b) measurement results by different dilution methods

2.2 動態(tài)稀釋EA-IRMS對不同樣品δ13C和δ15N測定的重復性

具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS對不同樣品δ13C和δ15N的測定結(jié)果列于表2。被測樣品的C、N元素含量(0.2%～78.8%和0.077%～29.7%)及C/N(1.68～219)的變化范圍均較大，且每種樣品的3組平行取樣量變化較大，同一樣品最大與最小取樣量的比例最高接近10倍。動態(tài)稀釋過程中，通過He將CO2或N2樣品氣進行了全動態(tài)稀釋，使CO2或N2樣品氣與相應參考氣的信號強度(m/z44：6 V或m/z28：1.5 V)始終保持一致。結(jié)果表明，被測樣品δ13C和δ15N變化分別為-27.9‰～-13.9‰和-0.9‰～8.5‰，測定精度分別為0.07‰～0.32‰和0.05‰～0.27‰，滿足EA-IRMS測試要求[12-13]。該結(jié)果進一步表明，具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS能夠測定同一測試序列內(nèi)具有不同質(zhì)量及C/N的樣品。該聯(lián)機系統(tǒng)可以為提高δ13C和δ15N的分析效率提供強有力的工具[8]。

表2 動態(tài)稀釋EA-IRMS對不同類型樣品δ13C和δ15N的測定結(jié)果Table 2 δ13C and δ15N measurement results of different types of samples by EA-IRMS equipped with dynamic dilution component

續(xù)表2

注：δ13C和δ15N采用平均值±1SD/‰表示

圖3 動態(tài)稀釋EA-IRMS在不同時間測定δ13C(a)和δ15N(b)結(jié)果的一致性Fig.3 Consistency of δ13C (a) and δ15N (b) measurement results by EA-IRMS equipped with dynamic dilution component at different time

2.3 動態(tài)稀釋EA-IRMS在不同測量時間上的再現(xiàn)性

具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS在不同時間的δ13C和δ15N測定結(jié)果示于圖3。2次測定(間隔45天)中，δ13C和δ15N的測定結(jié)果不存在顯著差異(p>0.05)，表明該聯(lián)機系統(tǒng)的測定結(jié)果再現(xiàn)性良好。同一樣品中，δ13C和δ15N的2次測定結(jié)果的平均偏差分別為(-0.05±0.35)‰和(0.16±0.37)‰，能夠滿足實驗室測試要求[12-13]。需要指出的是，土壤δ13C、豬肉脂肪δ13C和菠菜δ15N在不同時間的測定偏差均超過了±0.3‰。這可能由于上述樣品在較長的貯存時間內(nèi)產(chǎn)生了同位素分餾效應[14-16]。另外，樣品均勻性較差和測定次數(shù)較少也可能導致較大的測定偏差。因此，建議在今后的研究中縮短樣品分析周期，均勻研磨與取樣，適當增加平行實驗，以提高δ13C和δ15N的測定準確性[15,17-19]。

3 結(jié)論

本研究采用具有動態(tài)稀釋功能的EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)，快速測定了不同類型的固體和粘稠樣品的δ13C和δ15N，并與傳統(tǒng)方法進行對比。結(jié)果表明，該聯(lián)機系統(tǒng)對δ13C和δ15N的測定結(jié)果與傳統(tǒng)固定比例稀釋、不稀釋法相比具有較好的一致性，3種稀釋法測定結(jié)果的平均偏差為±0.15‰，能夠滿足實驗室測試要求。通過測定具有不同C、N含量和C/N比值的9種樣品，結(jié)果表明，該聯(lián)機系統(tǒng)對δ13C和δ15N的測定結(jié)果具有良好的重復性。利用He對樣品氣進行全動態(tài)稀釋，可使樣品氣與參考氣的信號強度保持在相等水平，δ13C和δ15N的平均精度均優(yōu)于0.2‰。此外，該聯(lián)機系統(tǒng)在不同測量時間(間隔45天)具有較好的再現(xiàn)性，大部分樣品δ13C和δ15N的2次測定結(jié)果偏差分別小于0.2‰和0.3‰。該研究結(jié)果對提高EA-IRMS的δ13C和δ15N測定效率具有借鑒意義。