親和超濾質(zhì)譜技術(shù)在中藥活性成分篩選中的研究進(jìn)展

周 慧，王義民，鄭 重，劉 舒，劉志強(qiáng)

(1.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海 519041；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長春 130022)

中藥活性成分篩選研究是中藥現(xiàn)代化的重要組成部分，也是實(shí)現(xiàn)中藥“走出去”的必經(jīng)之路。較之傳統(tǒng)的人工合成藥物設(shè)計(jì)模式，中藥化學(xué)成分的多樣性使其在新藥研發(fā)方面體現(xiàn)出較大優(yōu)勢。從中藥成分中篩選得到的活性物質(zhì)往往結(jié)構(gòu)新穎、療效高、不良反應(yīng)少，既可以直接開發(fā)為新藥，也可以作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾與優(yōu)化后成為一代新藥[1]，現(xiàn)已成為制藥工業(yè)中新藥研發(fā)的來源之一。根據(jù)文獻(xiàn)[2]報(bào)道，在過去30多年時間里，超過50%已批準(zhǔn)上市的藥物直接或間接來源于天然產(chǎn)物。因此，以中藥為來源的藥物活性成分篩選受到新藥研發(fā)工作者的推崇。

傳統(tǒng)的中藥活性成分篩選模式主要以多次提取、分離為基礎(chǔ)，其基本思路是利用體外藥效評估對提取分離的每一階段組分進(jìn)行活性評價，追蹤其活性組分，然后繼續(xù)追蹤活性顯著組分，直至獲得活性單體成分。但這種研究策略往往實(shí)驗(yàn)周期長、工作量大，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量篩選，而且該篩選模式忽略了中藥多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，導(dǎo)致篩選出的一些藥物藥用效果較差[3]。因此，基于疾病靶點(diǎn)的、以活性為導(dǎo)向的高通量篩選研究十分必要。

近年來，隨著“精準(zhǔn)醫(yī)療”計(jì)劃的提出，傳統(tǒng)的藥物研究模式已經(jīng)轉(zhuǎn)向了“精準(zhǔn)”靶向藥物分子設(shè)計(jì)策略[4-5]。以靶標(biāo)-配體精確相互作用為理論基礎(chǔ)，通過藥物活性成分與疾病相關(guān)的特定生物靶點(diǎn)相互作用，發(fā)現(xiàn)對靶蛋白具有親和力、特異性強(qiáng)的小分子配體。親和超濾質(zhì)譜(affinity ultrafiltration mass spectrometry, AUF-MS)篩選技術(shù)符合精準(zhǔn)醫(yī)療時代下靶向藥物研究的需求，其利用小分子藥物配體和靶標(biāo)之間特異性結(jié)合的特性，將具有潛在活性的小分子化合物的混合物與靶標(biāo)蛋白混合，得到靶標(biāo)-配體復(fù)合物和未結(jié)合的小分子，通過超濾裝置將未結(jié)合的小分子濾除后，將靶標(biāo)-配體復(fù)合物解離，釋放出與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的活性成分，再利用液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)技術(shù)分析活性化合物[6]。該技術(shù)可針對特定的疾病靶標(biāo)進(jìn)行全面、客觀的篩選，獲得的天然配體具有藥理活性顯著、靶向清晰、機(jī)制明確等特點(diǎn)，可作為新藥研發(fā)中具有臨床開發(fā)價值的候選化合物。由于利用該方法進(jìn)行篩選時，可洗掉大量無活性的化合物，加快了活性化合物的解析速度[7-8]。

特別是隨著HPLC-MS技術(shù)在分子質(zhì)量檢測范圍、靈敏度等方面性能的提高，使得親和超濾質(zhì)譜技術(shù)從復(fù)雜中藥體系中篩選和鑒定活性成分的優(yōu)勢更加明顯。

本工作將從親和超濾質(zhì)譜技術(shù)在中藥活性成分篩選中的原理、特點(diǎn)、應(yīng)用進(jìn)展等方面進(jìn)行綜述。

1 親和超濾質(zhì)譜概述

1.1 基本原理和分類

親和超濾是利用已知靶蛋白(受體)與未知體系小分子(配體)特異性地結(jié)合，通過超濾膜對不同大小物質(zhì)選擇性的差異實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)的快速分離和篩選。具體操作為：首先，將待篩選體系與選定的靶蛋白進(jìn)行孵育，使得有親和活性的小分子與靶蛋白活性位點(diǎn)特異性結(jié)合形成受體-配體復(fù)合物，沒有親和活性的化合物則游離出來[9]。然后，利用超濾膜的選擇透過性，用緩沖液將未與靶蛋白結(jié)合的化合物洗脫下來，將超濾膜截留下來的復(fù)合物用一定比例的有機(jī)溶劑處理，或者改變體系的pH值使受體蛋白變性，釋放出小分子配體。最后，利用HPLC-MS技術(shù)快速分析和鑒定小分子活性物質(zhì)，其原理示于圖1。

親和超濾技術(shù)分為脈沖超濾和離心超濾[11]。兩者篩選小分子活性物質(zhì)的基本原理相同，均是通過半透膜的選擇特異性達(dá)到富集配體的目的[12-13]。脈沖超濾的操作單元由超濾室(分為上室和下室)、磁力攪拌器和超濾膜組成[14]，脈沖超濾室的兩室之間被超濾膜隔開。脈沖超濾的基本篩選過程為：將受體-配體的混合物置于超濾膜上，通過施加一定的壓力, 選擇與受體有一定親和能力的配體，再通過HPLC-MS法對選擇得到的配體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。在脈沖超濾中，可以根據(jù)受體-配體混合液體積選擇超濾室的大小，還可對超濾室進(jìn)行控溫，以優(yōu)化受體-配體反應(yīng)溫度[15]。離心超濾則采用商品化的超濾離心管，通過離心篩選化合物，不需復(fù)雜的操作程序，且實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性良好。但是，較之脈沖超濾，離心超濾過程中往往存在濃差極化現(xiàn)象，導(dǎo)致超濾膜的過濾速度降低，嚴(yán)重的會導(dǎo)致蛋白在膜表面吸附和沉積，從而影響游離藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)。離心超濾與脈沖超濾的差異決定了它們的應(yīng)用范圍不同。離心超濾不能與質(zhì)譜在線聯(lián)用，主要用于小分子化合物的篩選，應(yīng)用范圍小；脈沖超濾可以實(shí)現(xiàn)與質(zhì)譜在線連接，適用于從組合化學(xué)庫和天然產(chǎn)物庫中篩選小分子物質(zhì)，尤其在計(jì)算靶標(biāo)和配體的結(jié)合常數(shù)及藥物代謝研究方面優(yōu)勢明顯[15-16]。

圖1 超濾質(zhì)譜技術(shù)工作原理示意圖[10]Fig.1 Scheme of ultrafiltration mass spectrometry[10]

1.2 親和超濾質(zhì)譜的特點(diǎn)和優(yōu)勢

傳統(tǒng)的中藥成分活性物質(zhì)篩選研究模式通常是對中藥化學(xué)成分進(jìn)行提取、分離、結(jié)構(gòu)鑒定，然后進(jìn)行生物活性測定，確定有效成分。該分離篩選過程操作繁瑣、耗時長、對環(huán)境不友好，而且容易造成一些微量潛在活性物質(zhì)的丟失和大量假陽性結(jié)果的干擾[17]。相比之下，親和超濾質(zhì)譜技術(shù)在篩選活性物質(zhì)時具有操作簡單、效率高、成本低等特點(diǎn)。

首先，親和超濾所使用的靶分子用量少，且不需要經(jīng)過固定化處理，經(jīng)過有機(jī)溶劑處理和多次離心即可完成分離工作。這不僅簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，而且避免了蛋白受體經(jīng)固定化處理帶來的變性與失活。其次，由于蛋白受體和小分子配體是在天然溶液狀態(tài)下進(jìn)行反應(yīng)的，不需要進(jìn)行標(biāo)記，因此能夠保持蛋白的天然構(gòu)象；同時，能夠控制受體和配體的孵育溫度，使其在接近生理?xiàng)l件下客觀地反映藥物小分子和生物大分子的相互作用。另外，超濾實(shí)驗(yàn)所需要的靶標(biāo)用量少，尤其對于價格昂貴的蛋白靶分子，實(shí)驗(yàn)后經(jīng)處理可重復(fù)使用，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。最后，通過超濾裝置與具有分離能力的色譜和具有結(jié)構(gòu)鑒定能力的質(zhì)譜聯(lián)用，使活性化合物的篩選、分離、鑒定(定性與定量)成為一個連續(xù)的過程，實(shí)現(xiàn)了高通量、高效率篩選。隨著更多類型質(zhì)譜儀的出現(xiàn)，超濾質(zhì)譜將會更大程度地滿足不同藥物活性成分結(jié)構(gòu)鑒定的需要[18]。

1.3 影響親和超濾質(zhì)譜分析的關(guān)鍵因素

在超濾篩選實(shí)驗(yàn)過程中，為了減少假陽性或假陰性結(jié)果的干擾，獲得理想的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時必須考慮以下因素：超濾膜的選擇、受體的使用劑量、解離液的選擇等。

1.3.1超濾膜的選擇 在親和超濾過程中，超濾膜的選擇決定著篩選結(jié)果的準(zhǔn)確與否。選擇超濾膜一般需要遵循2個原則：1) 在選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)盡可能減少靶蛋白和配體與膜的非特異性吸附，目前應(yīng)用較多的材質(zhì)主要有再生纖維素、甲基纖維素、聚砜類、PEEK等。2) 根據(jù)分子截留量的大小選擇合適孔徑的超濾膜，膜的孔徑過小，容易造成膜的堵塞而產(chǎn)生高壓，影響膜的過濾效率；膜的孔徑過大，容易造成漏篩，同時降低了分子間的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，易導(dǎo)致膜的破裂[14,17]。根據(jù)以往的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，超濾膜的截留分子質(zhì)量應(yīng)該小于靶蛋白分子質(zhì)量的1/3，例如當(dāng)靶分子分子質(zhì)量為25 ku時，可以選擇截留量為8 ku的超濾膜[17]。

1.3.2受體的使用劑量 實(shí)驗(yàn)中受體的使用劑量會在一定程度上影響篩選結(jié)果。在反應(yīng)體系中，如果受體的濃度遠(yuǎn)大于配體，則所有潛在的配體都會與受體結(jié)合，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果；如果配體濃度遠(yuǎn)大于受體，則只有結(jié)合能力強(qiáng)的配體才能與受體結(jié)合，從而導(dǎo)致結(jié)合力弱的潛在活性物質(zhì)被過濾掉，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。通常來說，確定受體的使用劑量時，應(yīng)盡量保證靶標(biāo)與配體的濃度適中，且受體的濃度與結(jié)合能力最弱配體的Kd值近似相等[15]。

1.3.3解離液的選擇 在配體和受體完成特異性結(jié)合后，影響篩選結(jié)果的關(guān)鍵是如何成功地將配體從復(fù)合物中解離出來，并盡可能減少非特異性吸附。目前，配體的解離方法主要包括向溶液中加入一定比例的有機(jī)溶劑或者加入酸堿溶液以改變體系pH值，使蛋白變性失活，釋放出配體分子。

單一使用有機(jī)溶劑解離液可能會增加非特異性吸附，造成假陽性結(jié)果，而使用含酸的有機(jī)溶劑則能夠減少配體與超濾膜的非特異性結(jié)合。Nikolic等[19]考察了80%甲醇和10%甲醇+2%醋酸分別作為洗脫液時，乙嘧啶、甲氧芐氨嘧啶、雙嘧達(dá)莫這3種存在非特異性結(jié)合的物質(zhì)被洗脫下來的響應(yīng)信號強(qiáng)度，結(jié)果表明，使用10%甲醇+2%醋酸解離液比80%甲醇解離液獲得的假陽性信號明顯降低。本課題組Xu等[20]利用超濾技術(shù)從中藥復(fù)方二妙丸中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選擇含酸的甲醇-水洗脫液時(50∶50，V/V，pH3.3)，對比實(shí)驗(yàn)組和空白組的色譜圖，非特異性結(jié)合物質(zhì)的響應(yīng)信號較低。因此，在進(jìn)行超濾篩選時，為了在一定程度上減少非特異性結(jié)合，最好選擇含酸的有機(jī)溶劑作為解離液。

1.3.4其他影響因素 對于離心超濾，除了以上3個重要因素外，靶蛋白與被篩選物質(zhì)的孵育時間、溫度、漂洗次數(shù)、離心轉(zhuǎn)速與次數(shù)等都會影響篩選結(jié)果。如果蛋白與被篩選樣品的孵育時間過短，相互作用不充分，容易造成漏篩；若孵育時間過長，兩者可能發(fā)生反應(yīng)，活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響結(jié)果準(zhǔn)確性；孵育溫度的選取會影響蛋白酶的活性；離心轉(zhuǎn)速與次數(shù)的選取會影響蛋白與配體間的相互作用。親和超濾方法不能完全消除假陽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即不能完全避免配體與靶蛋白的非特異性結(jié)合。因此，在進(jìn)行超濾實(shí)驗(yàn)時，除了增加陰性對照組以減少假陽性結(jié)果外，還可在復(fù)合物解離前用緩沖液進(jìn)行多次漂洗，以最大程度減少非特異性吸附。

2 親和超濾質(zhì)譜技術(shù)在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用

中藥作為大自然的分子寶庫，為藥物研發(fā)提供了豐富的化合物來源。目前，對于中藥活性物質(zhì)的研究主要以大規(guī)模提取分離為基礎(chǔ)。首先，通過多步分離、純化，獲得單體化合物；然后，通過核磁、質(zhì)譜等技術(shù)手段對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)；最后，使用經(jīng)典的動物、細(xì)胞模型進(jìn)行生物學(xué)活性評價。這種研究策略往往實(shí)驗(yàn)周期長、工作量大，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量篩選，而且難以分離和提純具有潛在活性的微量成分。親和超濾質(zhì)譜技術(shù)不但簡化了活性成分的分離、純化步驟，可使中藥活性成分的篩選與結(jié)構(gòu)鑒定一步完成，而且能夠有效避免微量活性物質(zhì)的漏篩和雜質(zhì)干擾，可提高篩選結(jié)果的準(zhǔn)確率，現(xiàn)已廣泛用于中藥活性成分研究。

本課題組運(yùn)用親和超濾質(zhì)譜技術(shù)，從中藥復(fù)雜體系中成功篩選出多種α-葡萄糖苷酶抑制劑、黃嘌呤氧化酶抑制劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑，并考察了中藥提取物與生物大分子DNA、人血清白蛋白的相互作用。Zhou等[21]利用離心超濾質(zhì)譜技術(shù)成功地從刺五加葉中鑒定出7種具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的物質(zhì)，包括4種黃酮類化合物、3種酚酸類化合物。然后，利用體外酶活性測定方法進(jìn)一步比較了刺五加葉提取物中各相關(guān)化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。結(jié)果表明，黃酮醇類糖苷與α-葡萄糖苷酶的作用強(qiáng)度與糖配基的類型有關(guān)；咖啡?？鼘幩犷惢衔锏摩?葡萄糖苷酶抑制活性不僅與咖啡?；臄?shù)目有關(guān)，而且與咖啡?；涂鼘幩峄鶊F(tuán)連接的位點(diǎn)有關(guān)。Liu等[22]運(yùn)用超濾篩選結(jié)合超高效液相色譜-電噴霧多級串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-DAD-ESI-MSn)和傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FT-ICR-MS)技術(shù)成功地從丹參提取物中篩選出12種具有黃嘌呤氧化酶抑制作用的物質(zhì)，并運(yùn)用Nikolic等[19]評價COX-2抑制劑抑制能力的計(jì)算公式，得到這12種配體的富集因子。研究結(jié)果表明，1,2-萘醌基團(tuán)是抑制劑發(fā)揮抑制作用的重要結(jié)構(gòu)，脂環(huán)上的呋喃和羥基取代可以不同程度增強(qiáng)抑制劑的抑制能力，這一結(jié)果可為研發(fā)治療痛風(fēng)的藥物提供借鑒。

超濾質(zhì)譜技術(shù)以快速、靈敏、高通量的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于篩選中藥提取物中的活性成分。但是，目前超濾質(zhì)譜技術(shù)還存在一些不足，例如，化合物與目標(biāo)靶蛋白的非特異性結(jié)合會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，從而使篩選出的化合物表現(xiàn)出活性很弱或者完全沒有活性。為減少假陽性結(jié)果，在超濾篩選時可以引入變性酶作為對照組。Yang等[23]分別以活性酪氨酸酶和變性酪氨酸酶為靶標(biāo)進(jìn)行了2個平行實(shí)驗(yàn)，采用UPLC-DAD-MSn技術(shù)對實(shí)驗(yàn)組和對照組的濾液進(jìn)行分析，從桑椹葉提取物中成功篩選鑒定出12種具有酪氨酸酶結(jié)合活性的物質(zhì)，再通過體外酶活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，最后發(fā)現(xiàn)了槲皮素D-吡喃葡萄糖苷和山奈酚D-吡喃葡萄糖苷2種新的酪氨酸酶抑制劑。

引入變性酶作為對照組雖然在一定程度上可以減少假陽性結(jié)果，但是，一些靶蛋白變性后溶解度會下降，影響篩選結(jié)果。為解決這一問題，Song等[24]引入了靶蛋白酶活性位點(diǎn)阻斷劑，從菊花中篩選并鑒定出4種黃嘌呤氧化酶抑制劑。非布索坦是黃嘌呤氧化酶的強(qiáng)效抑制劑，當(dāng)其在復(fù)雜體系中與潛在的抑制酶共存時，能夠與潛在配體在黃嘌呤氧化酶活性位點(diǎn)上產(chǎn)生競爭性結(jié)合，從而間接減少化合物和靶分子的過度結(jié)合。利用這一特性，通過比較添加了競爭性配體(非布索坦)的實(shí)驗(yàn)組和未添加非布索坦的對照組解離液的色譜圖，發(fā)現(xiàn)具有潛在抑制活性的物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)組的色譜圖中的峰高要明顯低于對照組，實(shí)驗(yàn)過程示于圖2。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入酶活性位點(diǎn)阻斷劑可以有效減少非特異結(jié)合引起的假陽性結(jié)果，從而提高親和超濾的準(zhǔn)確性。在此基礎(chǔ)上，該課題組將親和超濾與分子芯片對接技術(shù)相結(jié)合，研究小分子與酶的相互作用，篩選潛在的天然酶抑制劑[25]。具體篩選過程為：首先，利用親和超濾質(zhì)譜技術(shù)從提取物中篩選出小分子活性物質(zhì)；其次，對篩選出的小分子活性物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到一系列新的化合物；最后，利用分子芯片對接技術(shù)模擬結(jié)構(gòu)改造后的新化合物與靶分子之間的相互作用，預(yù)測它們的活性，并結(jié)合體外酶活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。該課題組將超濾與分子芯片對接技術(shù)應(yīng)用于篩選中藥復(fù)方制劑脈絡(luò)寧注射劑中的黃嘌呤氧化酶(XOD)抑制劑成分，成功篩選并鑒定出3種能夠與XOD特異性結(jié)合的活性成分。通過對篩選得到的3種成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到14種化合物，利用分子對接技術(shù)模擬了此14種化合物與XOD的結(jié)合情況，通過預(yù)測這些物質(zhì)的活性并結(jié)合體外酶活性實(shí)驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)3,4-二咖啡酰奎寧酸甲酯和3,5-二咖啡?？鼘幩峒柞閄OD的強(qiáng)效抑制劑，且測得此二者的IC50值低于已上市的抗痛風(fēng)藥別嘌呤醇。由此可見，利用超濾質(zhì)譜技術(shù)不僅可以從中藥提取物中直接篩選活性物質(zhì)，還可以結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)對已鑒定的活性物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造形成組合化學(xué)庫，從而進(jìn)行二次篩選，可為高活性中藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供信息和思路。

線粒體不僅是細(xì)胞內(nèi)能量合成的重要場所，還與氧自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞死亡進(jìn)程調(diào)控有關(guān)。早期研究表明[26]，帕金森病、阿爾茨海默氏癥、糖尿病、腫瘤等疾病和衰老均與線粒體功能異常有關(guān)，因此，以線粒體為藥理學(xué)靶點(diǎn)的藥物篩選意義重大。不同于常見的以單一靶蛋白為靶標(biāo)從復(fù)雜基質(zhì)中篩選活性物質(zhì)，Yang等[27]通過離心超濾與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了以線粒體為靶向的生物活性篩選平臺，并使用陽性對照組對該方法的適用性進(jìn)行評價，優(yōu)化了靶細(xì)胞器、樣品濃度和孵育時間，成功地檢測到19種生物活性化合物，并通過體外藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中9種物質(zhì)能夠與靶線粒體活性位點(diǎn)結(jié)合。楊興鑫等[28]應(yīng)用基于線粒體的離心超濾-液相色譜-質(zhì)譜法，從中藥葛根和川芎中篩選得到了23種可與線粒體結(jié)合的活性化合物，并鑒定了其中17種化合物。在此基礎(chǔ)上，采用體外藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了7種化合物具有調(diào)節(jié)線粒體功能的作用。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，洋川芎內(nèi)A和3’-羥基葛根素可抑制HepG2細(xì)胞增殖，提高缺氧/復(fù)氧所致?lián)p傷的心肌細(xì)胞存活率。該研究結(jié)果可為深入闡釋中藥治療線粒體相關(guān)疾病的機(jī)理及開發(fā)線粒體靶向新藥提供重要的科學(xué)依據(jù)。

圖2 加入非布索坦阻斷劑的親和超濾篩選示意圖[24]Fig.2 General workflow for AUF-MS screening method combined with febuxostat[24]

有研究者將親和超濾和代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行了藥物機(jī)制研究。Fu等[29]應(yīng)用基于高分辨質(zhì)譜的代謝組學(xué)分析技術(shù)從甘草粗提物中發(fā)現(xiàn)了30種和22種分別能與埃博拉病毒核蛋白和馬爾堡病毒核蛋白結(jié)合的配體，經(jīng)混合物單體分離、單體活性測定法結(jié)合生物化學(xué)分析方法，最終確定18-β甘草次酸和甘草查兒酮A能夠顯著降低病毒核蛋白的熱穩(wěn)定性并誘導(dǎo)形成核蛋白寡聚體，且應(yīng)用生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)18-β甘草次酸能有效阻止病毒RNA片段與埃博拉病毒核蛋白的結(jié)合。該研究結(jié)果揭示了中藥甘草在抗病毒方面的作用機(jī)制，為抗病毒藥物的開發(fā)提供了借鑒，并且為中藥甘草相關(guān)的復(fù)方研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

近年來，親和超濾質(zhì)譜與細(xì)胞和生化實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，已廣泛應(yīng)用于中藥提取物活性物質(zhì)篩選研究中。近6年來，親和超濾質(zhì)譜技術(shù)在中藥有效成分篩選中的研究實(shí)例列于表1。

表1 親和超濾質(zhì)譜技術(shù)在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用[9,17]Table 1 Application of AUF-MS to target-oriented drug discovery in screening active components of TCMs[9,17]

續(xù)表1

3 結(jié)論與展望

中藥發(fā)揮藥理作用具有多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)。因此，如何快速、一體化地實(shí)現(xiàn)中藥多種活性成分篩選及鑒定是艱巨卻意義重大的工作。基于靶標(biāo)，以生物活性為導(dǎo)向的親和超濾質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)，提高了從復(fù)雜中藥成分體系中識別目標(biāo)成分的特異性和靈敏性，且能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模、高通量篩選，已被研究者廣泛應(yīng)用到特定靶標(biāo)的活性物質(zhì)篩選中。在未來的研究中，可考慮以超濾技術(shù)為核心，設(shè)計(jì)在線超濾池，通過將多個超濾池并聯(lián)后與液相色譜串聯(lián)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)樣品的高通量超濾篩選。這樣，超濾技術(shù)不但可用于研究1種藥物與單一作用靶點(diǎn)或多個靶點(diǎn)的相互作用，還可研究多種藥物與單一作用靶點(diǎn)或多個靶點(diǎn)的相互作用，符合中藥治療疾病的整體作用理論。此外，超濾技術(shù)也可用于研究中藥小分子作用機(jī)制。隨著超濾膜分離和高分辨質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，親和超濾質(zhì)譜技術(shù)將在中藥活性成分研究，特別是高通量篩選方面發(fā)揮更大的作用。