食源性單增李斯特菌14種潛在毒力基因的檢測

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近年來， 隨著食品生產(chǎn)、銷售、環(huán)境和人們消費(fèi)習(xí)慣 等方面的變化， 食品安全的新威脅不斷涌現(xiàn)。食品流通過程中的微生物污染如果得不到良好的控制， 會對食品安全和人體健康造成嚴(yán)重威脅。食源性疾病主要由食源性微生物污染引起，是危害人類健康和社會 經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要公共衛(wèi)生問題[1-2]。

單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes， LM)是一種胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性菌，重要的食源性人獸共患病原菌之一[3]，可引起人和多種動物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等[4]。該菌是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一且分布范圍極廣，環(huán)境耐受性較強(qiáng)。大多數(shù)發(fā)達(dá)國家人類李斯特菌病發(fā)生率約為(2～15)/100萬人，死亡率為20% ～30%[5-6]，近年來因食品污染本菌而引起的食物中毒病例頻繁發(fā)生，使李斯特菌病作為一種重要的食源性傳染病在世界范圍內(nèi)對食品安全及人類健康造成極大的危害[7]。20世紀(jì)90年代，WHO將單增李斯特菌列為食品4大病原菌之一[8]。

LM含有眾多毒力基因，這些基因在感染機(jī)體和適應(yīng)環(huán)境的過程中發(fā)揮著重要作用。2016年Maury對104株不同來源的代表性LM菌株進(jìn)行全基因組序列分析，挖掘出15個LM高毒力分離株具備而參考菌株不具備的假定毒力因子基因/基因簇[9]。本試驗(yàn)以54株食源性LM分離株為對象，檢測其中14個潛在毒力基因的分布，為LM致病性和食品LM的溯源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株54株LM菌株分離自2014-2017年新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)8個師，常規(guī)送檢的冷凍魚糜制品、調(diào)理肉制品，生禽肉等1 027份食品中(表1)。

表1 菌株來源及潛在毒力基因攜帶率Tab.1 Source of strain and carrying rate of potential virulence genes

1.2主要試劑 PCR Mix、瓊脂糖、ddH2O、DL2000 DNA Marker均購自廣州東盛生物科技有限公司。腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技公司。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Maury等研究[9]提供的網(wǎng)址(http://www.ebi.ac.uk/)，獲得14個潛在毒力基因的序列，利用primer5.0自行設(shè)計(jì)引物(表2)，北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

表2 14個潛在毒力基因引物序列及片段大小Tab.2 Primer sequence and the product length of potential virulence genes

1.4細(xì)菌DNA提取 將54株菌株分別從-80 ℃取出，搖菌復(fù)蘇。按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，備用。

1.514種潛在毒力基因的PCR檢測 PCR擴(kuò)增體系:模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR mix 10 μL，然后加ddH2O至體積20 μL。95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每次檢測均設(shè)有相同體系的LM hly基因陽性對照和ddH2O空白對照。

1.6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 PCR產(chǎn)物，DL2000Marker分別置于2%瓊脂糖凝膠中，120V，50A電泳25 min，凝膠成像儀下觀察。

2 結(jié) 果

2.154株LM食品源分離株潛在毒力基因攜帶情況 以54株食源性LM的DNA為模板，采用特異性引物對14種潛在毒力基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明：不同食品種類來源的LM分離株均可檢測到不同的潛在毒力基因，其中5563分離株攜帶8個潛在毒力基因，攜帶率57.14%；2935、716、804、807、723、6072大、6008小，這7個分離株攜帶7個潛在毒力基因，攜帶率50%；935、938、15BW340、931、461、873、713、708、796、928、 872、573、763、19BS444、571、914、5573、6072小、4788、5567，這20個分離株攜帶6個潛在毒力基因，攜帶率42.86%；921、925、926、5570、 577、472、5470、2941、3251、2947、3189、802、5474、3195、802、2956、3101-1、14BW340大、13BW339，這19個分離株攜帶5個潛在毒力基因攜帶率35.71%；791、 502、 4786、3197、 502-2、 22N992這6個分離株攜帶4個潛在毒力基因，攜帶率28.58%；21L662分離株攜帶3個潛在毒力基因，攜帶率21.43%(表2)。

2014—2017年，在1 027件11大類食品中共檢出LM 54株，總檢出率為 5.25%，54株食源性LM中，54%來源于調(diào)理肉制品和生禽肉(圖1)。

圖1 54株食品源LM來源比率 Fig.1 Rate of source in 54 foodborne LM strains

2.214個潛在毒力基因檢出情況 14個潛在毒力基因的檢出率各有不同，除芳香族氨基酸合成因子，EsaC蛋白類似物，差向異構(gòu)酶/脫水酶家族蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子未檢出外，檢出率最高的是寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因98.15%(53/54)，檢出率最低的是Ⅱ型限制酶修飾系統(tǒng)Sau3 Al和磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)基因9.26%(5/54)。其余毒力因子基因的檢測率分別是：內(nèi)化素樣蛋白基因81.48%(44/54)、細(xì)胞壁表面錨定家族蛋白基因77.78%(42/54)、單價陽離子/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因64.81%(35/54)、肽聚糖結(jié)合蛋白基因59.26%(32/54)、組氨酸代謝系統(tǒng)基因53.70%(29/54)、合成致死KAR3樣蛋白基因51.85%(28/54)、精氨酸/鳥氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因35.19%(19/54)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因12.96%(7/54)(圖2)。

圖2 14個潛在毒力基因檢出率Fig.2 Detection rate of 14 potential virulence genes

3 討 論

目前，由LM,引起的食物中毒越來越多，自1926年首次分離到該病病原后，李斯特菌病現(xiàn)已呈世界性分布。近年來因食品污染該菌引起的食物中毒病例頻繁發(fā)生，使李斯特菌病成為一種重要的食源性傳染病，在世界范圍內(nèi)對食品安全和人類健康造成極大的危害[7]。隨著世界貿(mào)易的發(fā)展、飲食方式的變化以及李斯特菌病對人類生產(chǎn)生活影響的不斷加深，20世紀(jì)90年代，WHO將單增李斯特菌列為食品中4大病原菌之一[8]。

目前OIE手冊規(guī)定認(rèn)為所有LM分離株都具有相同的毒力，對公眾健康的威脅同樣嚴(yán)重；并且認(rèn)為LM主要危害孕婦、老人、新生兒及免疫低下的人群[10]。但是越來越多的研究表明LM的型別與致病性和毒力有一定的關(guān)聯(lián)，譜系1或血清型4b的LM毒力高于譜系2或1/2b，1/2a，1/2c。CC4，CC1，CC2，CC6克隆群的菌株不僅危害孕婦、老人、新生兒及免疫低下的人群而且危害健康人群，而屬于CC9，CC121克隆群的菌株則只能危害前者[11-15]。

本研究發(fā)現(xiàn)14個潛在毒力基因的檢出率明顯不同，寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白檢出率高達(dá)98.15%，但未檢測到EsaC蛋白類似物，芳香族氨基酸合成因子，差向異構(gòu)酶/脫水酶家族蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子這3種潛在毒力基因。54株LM攜帶3～8個不同的潛在毒力基因，其中攜帶5～6個潛在毒力基因的菌株所占比例高達(dá)72.2%，攜帶率高的菌株是否有更強(qiáng)的致病性。 這些基于泛基因組分析挖掘的潛在毒力基因是否與毒力密切相關(guān)，是否能與InlA等核心毒力基因形成強(qiáng)毒力菌株的診斷標(biāo)識還有待于更多試驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持， 但是54株食品源LM均攜帶潛在毒力基因的現(xiàn)況應(yīng)當(dāng)引起關(guān)注。

2016年Maury對104株不同來源的代表性LM菌株進(jìn)行全基因組序列分析，并結(jié)合菌株分離來源，臨床信息等，挖掘出15個高毒力分離株具備而參考菌株不具備的假定毒力基因/基因簇[9]，并對其中的LIPI-4即磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)攜帶LIPI-4基因簇的LM09-00558口服和靜脈注射進(jìn)入小鼠后，在腦中的載菌量高于參考株EGDe，但其他組織的載菌量沒有差異；LIPI-4基因缺失株在小鼠腦、母體胎盤和胎兒的載菌量極顯著低于親本株，但在血液中的載菌量沒有差異。由于LIPI-4是CC4克隆群獨(dú)有的，而CC4克隆群分離株中71.4%來自患病臨床，因此作者認(rèn)為LIPI-4是LMCC4克隆群高毒力的緣由[9]。

本試驗(yàn)對54株食源性LM檢測發(fā)現(xiàn)僅有461、873、928、5573、2947這5株菌中含有PTS基因，且461、873、928、5573菌株攜帶的潛在毒力基因相同，2947少攜帶一個基因(細(xì)胞壁表面錨定家族蛋白)，但丁劍等發(fā)現(xiàn)接種2947，461菌株的小鼠6天內(nèi)小鼠死亡率100%；而接種5573菌株的小鼠死亡率66.7%，因此推測LM毒力是多種毒力基因綜合作用決定的[16]。

對新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)食品中LM檢測結(jié)果顯示，食品中存在一定程度的污染，54株食源性LM中，53.7%來源于調(diào)理肉制品和生禽肉，對食品安全造成了主要威脅。連凱等人發(fā)現(xiàn)華東地區(qū)生肉及冷凍和冷鮮食品是LM 主要污染源[17]，而本研究中54株LM的主要來源與華東地區(qū)LM食品污染主要來源不同，這說明食源性LM的流行具有地域性，與地區(qū)飲食狀況及生活習(xí)慣有關(guān)，因此分析食源性LM的主要來源 對于李斯特菌病的預(yù)防控制具有重要公共衛(wèi)生意義。