姜黃素類似物L(fēng)6H4對2型糖尿病及高脂大鼠腦的保護作用

王芳 董細(xì)丹 項蘭婷 陳三妹 陳國榮

糖尿病腦病是2型糖尿病所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一大并發(fā)癥。已有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腦病的發(fā)病率及致死率與高糖血癥、高脂血癥密切相關(guān)，高脂血癥不僅可以獨立增加腦梗死、腦缺血等腦血管事件，造成腦損傷；還可促進糖尿病發(fā)生、發(fā)展，增加腦損傷風(fēng)險。糖尿病及高血糖所致腦損傷的具體機制尚不清楚，涉及炎癥、細(xì)胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙等，多種因素如高血糖環(huán)境、胰島素抵抗、糖皮質(zhì)激素、氧化應(yīng)激、肥胖癥和高瘦素血癥等在其形成過程中發(fā)揮重要作用[1]。多種姜黃素衍生物被證實具有較強的抗炎、抗氧化應(yīng)激等功能，廣泛用于腫瘤動物模型及急性腦損傷動物模型的研究，而姜黃素類似物L(fēng)6H4對高脂高糖喂養(yǎng)加鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠腦的作用及機制的研究鮮見報道[2]，本實驗以姜黃素類似物L(fēng)6H4治療糖尿病及高脂大鼠，探討L6H4對高脂及高糖引起的腦損傷的保護作用及機制，為糖尿病及其并發(fā)癥，尤其是糖尿病腦病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及模型建立 SPF級雄性SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用抽簽法隨機抽取8只大鼠作為正常組，使用常規(guī)飼料喂養(yǎng)；剩下52只大鼠作為實驗組，使用高脂高糖飼料喂養(yǎng)。兩組大鼠均喂養(yǎng)4周后，予禁食1h，測大鼠尾靜脈空腹血糖（FBG）。實驗組大鼠再采用抽簽法隨機分為高脂實驗組20只和糖尿病實驗組32只。糖尿病實驗組大鼠按30mg/kg單次腹腔注射STZ（STZ 溶于 0.1mmol/L檸檬酸緩沖液內(nèi)，pH 4.0），72h后檢測大鼠尾靜脈FBG，并于1周后復(fù)測，2次檢測結(jié)果均＞16.7mmol/L，則為造模成功，本實驗共有24只大鼠造模成功。造模成功大鼠采用抽簽法隨機分為糖尿病組10只和糖尿病治療組14只。高脂實驗組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，采用抽簽法隨機分為高脂組8只和高脂治療組12只。高脂治療組和糖尿病治療組分別按0.2mg（/kg·d）的劑量給予姜黃素類似物L(fēng)6H4（L6H4溶于1%羧甲基纖維素鈉內(nèi)）灌胃治療8周，每次灌胃量按1ml/100g計算得出，其余組分別給予同等容積羧甲基纖維素鈉灌胃對照。實驗過程中共死亡12只大鼠（其中高脂治療組4只，糖尿病組2只，糖尿病治療組6只），實驗結(jié)束時，各組大鼠均剩8只。

1.2 藥品及主要試劑 姜黃素類似物L(fēng)6H4為溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院梁廣教授惠贈。羧甲基纖維素鈉購自美國Sigma公司；STZ購自上海潤朗生物科技有限公司；胰島素放免試劑盒購自上海瑞齊生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒及丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān) X 蛋白（Bax）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 大鼠體重及腦組織稱重 在整個實驗過程中，每周檢測大鼠體重（安靜狀態(tài)下電子秤測量），并在喂養(yǎng)結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后股動脈放血處死，解剖大鼠完整腦組織并稱重。

1.4 血生化指標(biāo)檢測 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后股動脈放血處死，收集血清，生化法檢測TG、TC、LDL、HDL。放射免疫法檢測FBG、空腹胰島素（FINS），并計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

1.5 腦組織病理形態(tài)觀察

1.5.1 HE染色 常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色觀察各組大鼠大腦、小腦、海馬結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5.2 髓鞘染色 常規(guī)石蠟切片，Luxol Fast blue髓鞘染色，觀察腦組織中髓鞘排列情況。

1.5.3 電鏡檢測 制備半薄切片及超薄切片，半薄切片甲苯胺藍(lán)染色定位并制作超薄切片（厚度100nm）；再醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，H-7500日立透射電子顯微鏡觀察大腦神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.6 腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平和SOD活性檢測取1g實驗大鼠腦組織，加0.9%氯化鈉溶液研磨，制成10%組織勻漿，2 500r/min低溫離心10min后取上清液，BCA法測定蛋白濃度。稀釋10倍后，TBA法檢測MDA水平，羥胺法檢測SOD活性。

1.7 腦組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。取20mg大鼠腦組織，常規(guī)提取腦組織蛋白，Bradford法檢測蛋白含量，蛋白樣品行電泳，轉(zhuǎn)膜后脫脂牛奶室溫封閉 1h，抗 Bax（1∶1 000）、抗 Bcl-2（1∶1 000）一抗4°C孵育過夜，TBST溶液洗滌，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h。化學(xué)發(fā)光顯影定影，以GAPDH抗體作為內(nèi)參照，用Bio-Rad Quantity One 4.6凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對各條帶進行相對定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。制圖使用實驗室數(shù)據(jù)分析和制圖軟件Graph Pad Prism 5。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較 在實驗過程中，正常組和高脂實驗組大鼠飲食、飲水、活動及大小便情況均正常，毛發(fā)光澤順滑；糖尿病組大鼠出現(xiàn)多尿、多飲、多食現(xiàn)象，體重減輕，行動遲緩，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，精神萎靡，毛發(fā)失去光澤、干燥、色黃；經(jīng)姜黃素類似物L(fēng)6H4干預(yù)后，糖尿病治療組大鼠較糖尿病組癥狀明顯減輕。

2.2 各組大鼠體重與大腦重量比較 實驗前，正常組大鼠體重 （[174.89±10.54）g]和實驗組大鼠體重（[183.28±20.85）g]比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；以不同飼料喂養(yǎng)4周后，實驗組大鼠體重（298.91±20.27）g，明顯高于正常組的（283.44±17.46）)g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗結(jié)束時，與正常組比較，高脂組體重明顯增加，糖尿病組體重明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；但高脂治療組和糖尿病治療組體重較高脂組和糖尿病組無明顯改善，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。各組大鼠大腦重量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。

2.3 各組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR比較 實驗前，正常組和實驗組大鼠FBG均在正常值范圍，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。實驗結(jié)束時，高脂組和糖尿病組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均較正常組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；且高脂治療組和糖尿病治療組FBG、FINS和HOMA-IR均較高脂組和糖尿病組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），提示姜黃素類似物L(fēng)6H4具有降低血糖及增加胰島素敏感性的作用，見表2。

表1 實驗結(jié)束時各組大鼠體重與大腦重量比較（g）

表2 各組大鼠FBG、FINS和H OM A-IR比較

2.4 各組大鼠血脂水平比較 高脂組和糖尿病組大鼠血清TG、TC、LDL水平及LDL/HDL值均較正常組明顯升高，血清HDL水平較正常組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。除血清HDL水平外，高脂治療組其余指標(biāo)與高脂組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），糖尿病治療組血清TG、TC、LDL、HDL水平及LDL/HDL值與糖尿病組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），提示姜黃素類似物L(fēng)6H4還具有降脂作用，見表3。

表3 各組大鼠血脂水平比較

2.5 大鼠腦組織光鏡下組織病理學(xué)變化

2.5.1 HE染色 正常組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整（圖1a，見插頁），小腦邊緣區(qū)浦肯野細(xì)胞完整（圖2a，見插頁），海馬齒狀回及 CA4區(qū)細(xì)胞排列整齊（圖3a，見插頁）。高脂組大鼠可見少量的神經(jīng)元細(xì)胞變性，核固縮，部分區(qū)細(xì)胞排列稍紊亂（圖1b、圖2b和圖3b，見插頁）。高脂治療組大鼠較高脂組病變減輕（圖1c、圖2c和圖3c，見插頁）。糖尿病組大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)目增多，可見噬神經(jīng)現(xiàn)象（圖1d，見插頁）；小腦邊緣區(qū)浦肯野細(xì)胞部分丟失，腦組織灶區(qū)明顯神經(jīng)元變性、壞死，白質(zhì)脫髓鞘現(xiàn)象可見（圖2d，見插頁）；海馬齒狀回及CA4區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核固縮、深染，顆粒層細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞變細(xì)、變長（圖3d，見插頁）。經(jīng)姜黃素類似物L(fēng)6H4治療后，糖尿病治療組大鼠上述組織病理改變均明顯減輕（圖1e、圖2e和圖3e，見插頁）。

2.5.2 髓鞘染色 正常組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)、白質(zhì)區(qū)、海馬等部位可見緊密、連續(xù)的神經(jīng)元細(xì)胞髓鞘（圖4a，見插頁）；高脂組和高脂治療組大鼠較正常組髓鞘結(jié)構(gòu)稍少、紊亂，但兩組差異不明顯（圖4b-c，見插頁）。糖尿病組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)等部位均可見髓鞘減少、丟失，部分區(qū)可見排列紊亂（圖4d，見插頁）。糖尿病治療組大鼠較糖尿病組排列紊亂及髓鞘丟失的情況減輕（圖4e，見插頁）。

2.6 大鼠腦組織電鏡下組織病理學(xué)變化 各組大鼠均取大腦皮質(zhì)區(qū)，電鏡下正常組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞完整，核圓、核膜完整，染色質(zhì)均勻，線粒體豐富（圖5a，見插頁）。高脂組和高脂治療組大鼠部分神經(jīng)元細(xì)胞核輕度固縮，兩組差異不明顯（圖5b-c，見插頁）。糖尿病組大鼠可見神經(jīng)元核明顯固縮，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)分布不均勻，線粒體減少，嵴變短、變稀，部分線粒體腫脹（圖5d，見插頁）。經(jīng)姜黃素類似物L(fēng)6H4治療后，糖尿病治療組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞較糖尿病組病變程度減輕（圖5e，見插頁）。

2.7 各組大鼠腦組織MDA水平和SOD活性比較 與正常組比較，高脂組大鼠MDA水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)姜黃素類似物L(fēng)6H4治療后，與高脂組比較，高脂治療組大鼠MDA水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，糖尿病組大鼠MDA水平升高、SOD活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。經(jīng)姜黃素類似物L(fēng)6H4治療后，與糖尿病組比較，糖尿病治療組大鼠MDA水平降低、SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

2.8 各組大鼠腦組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值比較 與正常組比較，高脂組和糖尿病組大鼠腦組織Bax蛋白表達(dá)水平、Bax/Bcl-2比值均升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。經(jīng)姜黃素類似物L(fēng)6H4治療后，與高脂組比較，高脂治療組大鼠腦組織Bax蛋白表達(dá)水平、Bax/Bcl-2比值均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與糖尿病組比較，糖尿病治療組大鼠腦組織Bax蛋白表達(dá)水平、Bax/Bcl-2比值均降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖6和表5。

表4 各組大鼠腦組織M DA水平和SOD活性比較

圖6 各組大鼠腦組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的電泳圖

表5 各組大鼠腦組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值比較

3 討論

糖尿病腦病是以獲得性認(rèn)知行為缺陷為主要臨床特征的糖尿病慢性并發(fā)癥。由于胰島素分泌不足導(dǎo)致體內(nèi)糖代謝紊亂，引發(fā)氧自由基大量產(chǎn)生，進而致廣泛的氧化應(yīng)激損傷，這一系列的病變發(fā)展過程是糖尿病致多器官損傷發(fā)生、發(fā)展的共同通路之一[3]。而在糖尿病腦病的發(fā)生、發(fā)展中，氧化應(yīng)激又扮演了十分重要的角色[4]。糖尿病動物腦組織存在氧化應(yīng)激的增加，其可以促成神經(jīng)元形態(tài)的改變及功能損傷，繼而導(dǎo)致動物認(rèn)知和行為缺陷。已有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激增加的個體不僅氧自由基產(chǎn)生過多，而且抗氧化防御系統(tǒng)受到損害，表現(xiàn)為氧自由基清除障礙，氧化還原穩(wěn)態(tài)紊亂[5]。據(jù)報道，隨著活性氧產(chǎn)生的增加，糖尿病大鼠腦中的抗氧化酶，即SOD和過氧化氫酶的活性降低[6]。本實驗結(jié)果顯示糖尿病組大鼠MDA水平明顯升高，SOD活性明顯降低，與研究報道一致。

氧化應(yīng)激還與線粒體功能障礙密切相關(guān)。線粒體既是氧化應(yīng)激的源頭又是氧化應(yīng)激的靶點，線粒體基因易受活性氧損傷。線粒體功能障礙與線粒體功能的損傷及腺嘌呤核苷三磷酸合成的減少直接相關(guān)，同時伴有氧自由基的增多[7]。Moreira等[8]認(rèn)為腦線粒體功能障礙是阿爾茨海默?。ˋD）和糖尿病之間的重要聯(lián)系。本實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病機體氧化應(yīng)激水平明顯增加，透射電鏡下可見線粒體嵴變短、變稀，部分線粒體腫脹明顯，提示線粒體形態(tài)及功能障礙與增加的氧化應(yīng)激水平及糖尿病所致的腦組織損傷密切相關(guān)。

氧化應(yīng)激在調(diào)控細(xì)胞凋亡中同樣扮演著重要角色。已有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病狀態(tài)下，體內(nèi)細(xì)胞較易出現(xiàn)凋亡調(diào)控紊亂現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在線粒體介導(dǎo)的凋亡通路。線粒體介導(dǎo)的凋亡通路屬于內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路，氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的氧自由基穿過線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜損傷，致使其通透性發(fā)生改變，使得線粒體內(nèi)膜的細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中激活凋亡執(zhí)行分子，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終使細(xì)胞進入凋亡[7]。此外氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的自由基可以直接損傷DNA進而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明在糖尿病狀態(tài)下自由基產(chǎn)物的增加能促進腦神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[9-10]。本實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠腦組織Bax蛋白表達(dá)水平、Bax/Bcl-2比值均升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低。經(jīng)姜黃素類似物L(fēng)6H4治療后，與糖尿病組比較，糖尿病治療組大鼠腦組織Bax蛋白表達(dá)水平、Bax/Bcl-2比值均降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，提示姜黃素類似物L(fēng)6H4對糖尿病誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護機制可能是通過抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡通路來實現(xiàn)的。

糖尿病及肥胖個體腦功能及結(jié)構(gòu)的損傷同炎癥反應(yīng)也是密切相關(guān)的。Valente等[11]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病并發(fā)AD患者腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化較AD組明顯增加。Sima等[12]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腦病個體腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞活化增多，促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6水平明顯增加，他們認(rèn)為糖尿病個體中存在晚期糖基化產(chǎn)物的增多及RAGE信號通路的上調(diào)，后者激活NF-κB通路及其下游，促進炎癥反應(yīng)，抑制抗凋亡體系，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。本實驗中，糖尿病大鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，可見明顯的噬神經(jīng)現(xiàn)象及膠質(zhì)結(jié)節(jié)的形成，說明炎癥在糖尿病個體的神經(jīng)元損傷中起重要作用。此外有實驗發(fā)現(xiàn)在高脂組大鼠腦和脂肪組織中TNF-α表達(dá)明顯升高，并可見小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化增加[13]。已有實驗證實肥胖大鼠受損的空間識別記憶，與促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）水平增加和海馬中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)減少相關(guān)，表明炎癥和記憶障礙之間具有密切關(guān)系[14]。

大量研究表明姜黃素具有抗腫瘤、抗炎及抗氧化應(yīng)激等多種生物活性，并對糖尿病的多種并發(fā)癥具有良好的治療作用，姜黃素類似物L(fēng)6H4以劑量依賴性方式抑制TNF-α和IL-6釋放，并且降低脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12 和環(huán)氧化酶 2（COX-2）mRNA的產(chǎn)生。姜黃素類似物L(fēng)6H4在機械水平上干擾JNK/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并且劑量依賴性地阻止ERK和p38活化。此外，姜黃素類似物L(fēng)6H4還能表現(xiàn)出對LPS誘導(dǎo)的死亡的顯著保護，并且能夠阻斷巨噬細(xì)胞中高葡萄糖激活的細(xì)胞因子表型。納米乳化的姜黃素通過減少促炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α及誘導(dǎo)型一氧化碳合酶等的表達(dá)從而降低糖尿病神經(jīng)病變相關(guān)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[15]。L6H4是以姜黃素為先導(dǎo)化合物，去除不穩(wěn)定的β-二酮基團后合成的姜黃素衍生物，除了具有姜黃素的生物活性外，具有更好的溶解性和生物利用度[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素類似物L(fēng)6H4具有明顯的抗凋亡作用，能有效地抑制糖尿病所致的腦組織損傷。糖尿病腦病為氧化應(yīng)激、炎癥等多種因素相互作用的結(jié)果，抗氧化應(yīng)激及抑制線粒體途徑的凋亡過程可能是姜黃素類似物L(fēng)6H4緩解糖尿病腦損傷的主要作用機制，另外調(diào)節(jié)血糖水平，減少糖代謝紊亂所致的氧自由基的生成以及抑制神經(jīng)元凋亡后的繼發(fā)炎癥反應(yīng)也為其可能的作用機制。姜黃素類似物L(fēng)6H4在預(yù)防糖尿病并發(fā)癥，尤其是糖尿病腦病中具有十分重要的潛在價值。