來那度胺抑制小鼠Lewis瘤作用機制的研究

楊毅 郭麗 李文燕 韓晨陽

來那度胺是沙利度胺的衍生物之一，屬于第二代免疫調(diào)節(jié)藥物[1]。來那度胺能夠調(diào)節(jié)細胞免疫和體液免疫，臨床主要用于各種惡性血液系統(tǒng)疾病的輔助治療，批準的適應證主要是骨髓增生異常綜合征中的5q-綜合征和多發(fā)性骨髓瘤。雖然后期在實體瘤的實驗中發(fā)現(xiàn)，來那度胺可以抑制腫瘤血管的形成、增強體內(nèi)免疫反應等[2-3]，但是在實體瘤的應用中始終具有一定的局限性。目前程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD1）抑制劑是腫瘤免疫抑制治療的研究熱點，PD1及其配體（PD1/PD-L1）作為免疫抑制的主要通路，在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。而前期研究中鮮有文獻報道來那度胺對免疫抑制的調(diào)節(jié)作用，就腫瘤藥物的研究，尋找一種既可以提高免疫功能又可以降低免疫抑制的藥物是有積極意義的。本研究通過觀察來那度胺對Lewis荷瘤小鼠T淋巴細胞亞群/樹突狀細胞比例和PD1/PD-L1通路的影響，探討來那度胺經(jīng)免疫途徑治療實體瘤的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級近親系C57BL/6J雄性小鼠40只，8～10周齡，體重18～22g，購于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心[實驗動物許可證號為SCXK（浙）2013-0184）]，分籠飼養(yǎng)，每籠8只，共5籠。動物實驗室溫度為20～25℃，濕度為（70±5）%，依據(jù)國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，小鼠活動、攝食自由。

1.2 細胞株與試劑 Lewis肺癌細胞株購于武漢普諾賽生物技術有限公司。來那度胺購于武漢卡斯恩化工有限公司（醫(yī)藥級，貨號15002719264），F(xiàn)ITC標記的小鼠CD4、CD80抗體，PE標記的小鼠CD8、CD11c抗體購于美國Bio Legend公司。PD1、PD-L1的一抗和二抗購于美國Sigma公司。

1.3 來那度胺對細胞的毒性作用鑒定 Lewis肺癌細胞株進行貼壁培養(yǎng)，待對數(shù)生長期時消化得到細胞懸液，調(diào)整細胞懸液濃度為2×106/ml，在96孔板中每孔加入細胞懸液100μl，設置對照組和來那度胺組（濃度依次為 1、5、10、20、40、80μM），每組 5 個復孔分別培養(yǎng)24、48和 72h，CCK8法檢測細胞活力，Hoechst 33258染色檢測凋亡細胞。

1.3.1 CCK8法檢測細胞活力 將細胞接種到96孔板中，待細胞貼壁后用不同終濃度來那度胺干預一定時間后，棄去培養(yǎng)基，加入100μl的新培養(yǎng)基和10μl的CCK8溶液繼續(xù)孵育4h，同時設置空白培養(yǎng)基為對照，酶標儀檢測細胞吸光度值（A），計算細胞活力。細胞活力=[（實驗組A-空白對照A）/（對照組A-空白對照A）]×100%。

1.3.2 Hoechst 33258染色檢測凋亡細胞 將細胞接種到24孔板中，待細胞貼壁后用終濃度為80μl的來那度胺干預一定時間后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次后甲醇固定，加入Hoechst 33258染色液染色0.5h后，PBS洗3次后在鏡下觀察細胞，其中藍色強熒光為陽性細胞，代表凋亡細胞。

1.4 小鼠造模和分組 取正常小鼠，在無菌條件下取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細胞株進行接種，調(diào)整細胞懸液濃度為2×106/ml，在每只小鼠右側腋窩下接種細胞懸液0.5ml，接種后常規(guī)飼養(yǎng)5d，選取荷瘤建模成功的小鼠分設模型組、來那度胺低劑量組（1mg/kg）和高劑量組（10mg/kg），另擇正常小鼠設為對照組，每組10只。來那

度胺用0.9%氯化鈉溶液配置成50mg/ml混懸液，低劑量組劑量為1mg/kg，高劑量組劑量為10mg/kg，對照組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，均每天灌胃1次，連續(xù)14d，斷頸處死，取腫瘤組織和外周血進行實驗。

1.5 體內(nèi)抑瘤率測定 實 驗期間每日觀察小鼠的生長期情況和腫瘤大小，給藥14d后處死小鼠，解剖并分離腫瘤，對腫瘤進行稱重，計算抑瘤率，抑瘤率=（模型組平均腫瘤重量-來那度胺組平均腫瘤重量）/模型組平均腫瘤重量×100%。

1.6 腫瘤細胞的分離 腫 瘤稱重后，置于含有青霉素（100U）和鏈霉素（100μg/L）的培養(yǎng)基中浸泡 1 h，用無菌手術剪剪成小塊，加入膠原蛋白酶Ⅳ和脫氧核糖核酸酶（濃度均為0.05%），消化后進行無菌銅網(wǎng)過濾，得到細胞懸液，1 500r/min離心10min得到細胞。

1.7 T淋巴細胞亞群/樹突狀細胞比例檢測 采 用流式細胞術。將上述分離得到的腫瘤細胞和外周血細胞調(diào)節(jié)濃度為1×106/ml，分別分設3管，每管加入0.5ml細胞懸液（含5×105個細胞），離心后棄去培養(yǎng)基后用PBS調(diào)整總體積為 1 00μl，第 1管中加入 C D4和 C D8抗體0.5μl，第 2 管中加入 C D11c 和 C D80 抗體 0 .5μl，第 3管為空白對照，避光孵育0.5h，PBS洗2次后上機檢測。

1.8 PD1/PD-L1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。將分離得到的細胞調(diào)節(jié)細胞濃度為2×106/ml，用RIPA和PMSF提取細胞總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白質樣品，與5×蛋白上樣緩沖液混合，沸水煮5min變性，經(jīng)SDS-PAGE，蛋白從凝膠中轉移到PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的TBST封閉2h。加入一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，5min/次，加入HRP標記的二抗室溫孵育2h，ECL顯影，曝光后用Image J軟件分析，蛋白質的相對表達為每個蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值。

1.9 統(tǒng)計學處理 采 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 來那度胺對Lewis肺癌細胞株的細胞毒性作用在不同濃度來那度胺干預24、48和72h后，Lewis肺癌細胞株均未出現(xiàn)細胞毒性反應，細胞活力均在95%以上。同一時間點不同濃度來那度胺組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），且不同濃度來那度胺組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。Hoechst 33258染色也證明細胞無顯著凋亡，提示來那度胺對Lewis肺癌細胞株無明顯細胞毒性，見圖1（插頁）。

表1 不同濃度來那度胺干預后Lewi s肺癌細胞株的細胞活力（%）

2.2 來那度胺對Lewis荷瘤小鼠的抑瘤率 高劑量組、低劑量組腫瘤重量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；高劑量組腫瘤重量低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高劑量組抑瘤率高于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。2.3 來那度胺對T淋巴細胞亞群/樹突狀細胞比例的影響 對于T淋巴細胞亞群，來那度胺可以提高腫瘤浸潤組織和外周血中CD4+、CD8+比例。高劑量組、低劑量組CD4+、CD8+比例均高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；且高劑量組 CD4+、CD8+比例高于低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。對于樹突狀細胞，來那度胺可以提高腫瘤浸潤組織和外周血中 CD11c+、CD80+及兩者雙陽性 （CD11c+CD80+）比例。高劑量組、低劑量組 CD11c+、CD80+、CD11c+CD80+比例均高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而低劑量組和高劑量組 CD11c+、CD80+和 CD11c+CD80+比例比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表3。

表2 來那度胺對Lewi s荷瘤小鼠的抑瘤率

表3 來那度胺對腫瘤浸潤組織和外周血中T淋巴細胞亞群/樹突狀細胞比例的影響

2.4 來那度胺對腫瘤組織中PD1、PD-L1蛋白表達的影響 高劑量組、低劑量組PD1和PD-L1蛋白表達水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；高劑量組PD1和PD-L1蛋白表達水平均低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2和表4。

圖2 腫瘤組織中PD-1/PL-L1蛋白表達的電泳圖

表4 來那度胺對腫瘤組織中PD1、PD-L1蛋白表達水平的影響

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后和人體自身的免疫是息息相關的，而機體的抗腫瘤免疫主要依靠自身的T淋巴細胞所介導的細胞免疫[4]。成熟的T淋巴細胞一般分為CD4+和CD8+亞群，而缺乏CD4+和CD8+細胞可以直接導致機體免疫低下，促進腫瘤的發(fā)展[5]。樹突狀細胞是目前人體內(nèi)功能最強的專職抗原呈遞細胞，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者存在樹突狀細胞缺乏的免疫缺陷[6-7]。因此，淋巴細胞亞群的變化和樹突狀細胞的變化可以直接反映出機體的免疫功能。人體也存在免疫抑制功能，目前公認的PD1和PD-L1在腫瘤細胞的淋巴細胞的相互結合中發(fā)揮重要的免疫抑制作用[8-9]。PD1是CD28超家族成員，表達在淋巴細胞的表面，且廣泛存在于各種T淋巴細胞、B淋巴細胞，而PD1的主要功能是調(diào)節(jié)效應淋巴細胞的活化[10]。PD1的配體主要是PD-L1和PD-L2，在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)PD-L1和PD1結合后可以誘導細胞毒性T細胞的凋亡，介導腫瘤細胞的免疫逃逸和轉移，而PD-L1在多數(shù)腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，這證明PD1和PD-L1在腫瘤的免疫抑制中發(fā)揮著重要作用[11-12]。

來那度胺是一種新型的免疫調(diào)節(jié)制劑。以往研究發(fā)現(xiàn)，在免疫調(diào)節(jié)方面，它可以通過激活T淋巴細胞產(chǎn)生IL-2、同時提高NK細胞的比例并增強其功能。在非免疫調(diào)節(jié)方面，來那度胺可以抑制IL-6表達，通過Caspase-8的表達介導細胞凋亡，還可以降低細胞色素C的釋放、抵抗腫瘤血管的生成[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，來那度胺對Lewis肺癌細胞株并無細胞毒性，不同劑量及延長作用時間并未有顯著作用，提示來那度胺對腫瘤細胞不具有直接的殺傷作用。本研究發(fā)現(xiàn)，來那度胺不僅可以提高腫瘤組織和外周血中CD4+、CD8+比例，增強T淋巴細胞的殺傷作用，還可以提高樹突狀細胞比例，且高劑量效果優(yōu)于低劑量，說明來那度胺對淋巴細胞的增殖和功能的增強有著很好的調(diào)節(jié)作用。在樹突狀細胞的表達中同樣顯示了來那度胺的免疫增強作用，外周血和腫瘤組織中淋巴細胞亞群變化呈現(xiàn)高度一致性，說明來那度胺不僅提高了腫瘤組織的免疫功能，還提高了機體整體的免疫功能。本研究發(fā)現(xiàn)Lewis荷瘤小鼠腫瘤組織中PD1和PD-L1蛋白水平呈高表達，這說明免疫抑制水平較高。來那度胺干預后可以顯著降低腫瘤組織中PD1和PD-L1蛋白表達水平，從實驗結果看，低劑量下就有很好的抑制效果，這種表達下降說明來那度胺可能對PD1/PD-L1信號有一定的干預作用，同時腫瘤重量明顯減輕，推測是由于來那度胺抑制PD1/PD-L1信號后提高了免疫殺傷作用。本研究發(fā)現(xiàn)來那度胺對實體瘤有一定的干預作用，機制可能與機體免疫功能的增強和免疫抑制信號的拮抗有關，在雙重作用下起到了抗實體瘤的作用。

綜上所述，來那度胺對肺癌實體瘤的作用不是通過細胞毒性，而是通過增強免疫功能，其機制可能與T淋巴細胞亞群、樹突狀細胞的調(diào)節(jié)及PD1/PD-L1的表達有關。