人參皂苷Rg3通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤生長的研究

黃捷 吳可人 徐濤 金法 葉志鵬 閻九亮 李寧

膽囊癌是最常見的膽道惡性腫瘤之一，其致病原因尚不十分清楚，癥狀缺乏特異性，惡性程度高，進(jìn)展快，轉(zhuǎn)移早且預(yù)后不良，確診時多屬晚期[1-2]，開發(fā)抑制其生長和轉(zhuǎn)移的藥物已成為一項(xiàng)重要課題。人參皂苷Rg3是從中藥人參中提取的單體成分，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并能選擇性抑制腫

瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤及腫瘤新生血管的形成，還能明顯提高化療療效[3-4]。本課題組前期研究證實(shí)，人參皂苷Rg3在分子水平上調(diào)C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous transcription factor，CHOP）表達(dá)并激活 Caspase12 依賴性細(xì)胞凋亡，抑制CHOP表達(dá)能夠顯著減弱人參皂苷Rg3對膽囊癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性和促凋亡作用[5]。本研究擬通過觀察人參皂苷Rg3對人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD裸鼠移植瘤生長的作用，探討人參皂苷Rg3通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激雙鏈RNA依賴性蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（pancreatic ER stress kinase，PERK）通路抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤生長的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來源 人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD購自上海復(fù)祥生物科技有限公司，人膽囊癌細(xì)胞加入RPMI1640培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 5周齡雄性BALB/c裸鼠12只，體重約20～23g，購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司，在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物房普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 主要試劑和儀器 人參皂苷Rg3（美國Sigma-Aldrich公司，貨號：SML0184）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Scientific公司）；PERK抗體（英國Abcam公司）；磷酸化 PERK（p-PERK）抗體、β-actin 抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2 alpha，eIF2α）抗體（美國Proteintech 公司）；脂質(zhì)運(yùn)載蛋白 2（lipocalin 2，Lcn2）抗體、磷酸化 eIF2α（p-eIF2α）抗體、轉(zhuǎn)錄激活因子 4（activating transcription factor 4，ATF4）抗體（美國 Affinity Biosciences公司）；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗、RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所）；Western blot實(shí)驗(yàn)設(shè)備（美國Bio-Rad公司）；酶標(biāo)儀（MK3，芬蘭雷勃公司）；成像系統(tǒng)（Tanon-5200，上海天能科技有限公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；倒置拍照顯微鏡（德國Leica公司）。

1.4 動物模型建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法將裸鼠分為人參皂苷Rg3灌胃組和對照組各6只。取指數(shù)生長期人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD，用PBS洗滌3次，重懸于PBS中并調(diào)整濃度為5×106/ml，于每只裸鼠右側(cè)腹股溝皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液（1×106/個人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD），細(xì)胞懸液接種7d后，觀察成瘤情況。待腫瘤長至50～70mm3開始進(jìn)行灌胃處理，人參皂苷Rg3組將人參皂苷Rg3按20mg/kg劑量溶于0.2ml 0.9%氯化鈉溶液后灌

胃，對照組用0.2ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，連續(xù)給藥3周。

1.5 瘤體積和瘤體質(zhì)量測量 灌 胃處理開始后每隔3d以游標(biāo)卡尺測量腫瘤長、短徑并計(jì)算瘤體積直至第21天灌胃結(jié)束，瘤體積＝（腫瘤長徑×腫瘤短徑2）/2。21d后處死小鼠，切除腫瘤并稱重后，凍存組織以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 p-PERK、PERK、p-elF2α、elF2α、ATF4 和 L cn2 蛋白表達(dá)水平檢測 采 用Western blot法。取凍存組織按照RIPA裂解液說明書裂解，BCA法測定蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。灌制12%分離膠、5%濃縮膠的SDS-PAGE凝膠，樣品蛋白（25～40μg/樣品）通過 S DS-PAGE 電 泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，PVDF膜孵育在含5%脫脂奶粉的封閉液平皿中（室溫下30min）。將一抗稀釋至適當(dāng)濃度（PERK、p-PERK、elF2α、p-elF2α、ATF4、Lcn2、β-actin稀釋度1∶1 000），加入封閉液中，4℃脫色搖床過夜，用TBST洗滌緩沖液在4℃下脫色搖床上洗滌，同上方法制備二抗稀釋液（1∶5 000），4℃下孵育 4 ～5h后，用 T BST洗滌緩沖液在4℃下脫色搖床上洗滌。加入ECL發(fā)光液，曝光后用Image J軟件分析，蛋白質(zhì)的相對表達(dá)為每個蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組裸鼠瘤體積和瘤體質(zhì)量比較 人參皂苷Rg3灌胃組裸鼠瘤體質(zhì)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。灌胃9d內(nèi)，兩組裸鼠腫瘤體積大小比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；但灌胃12d開始，人參皂苷Rg3灌胃組裸鼠瘤體積較對照組均明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），提示人參皂苷Rg3能抑制腫瘤體積增長，見表1。

2.2 兩組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 人參皂苷Rg3灌胃組裸鼠p-PERK、p-elF2α、ATF4和Lcn2蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；但兩組裸鼠PERK和elF2α蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），提示人參皂苷Rg3能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK信號通路，見表2和圖1。

3 討論

研究表明人參皂苷Rg3能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，但其作用機(jī)制尚不完全清楚[6-8]。本課題組前期研究表明，人參皂苷Rg3對原發(fā)性膽囊癌細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性和促凋亡作用，但是對非癌膽囊上皮細(xì)胞無影響[5]。該研究證實(shí)人參皂苷Rg3在分子水平介導(dǎo)的病理性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是其對膽囊癌細(xì)胞作用的關(guān)鍵機(jī)制。本研究則通過檢測人膽囊癌細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中PERK 通路相關(guān)蛋白 p-PERK、PERK、p-elF2α、elF2α、ATF4和Lcn2的表達(dá)水平，探討人參皂苷Rg3對膽囊癌細(xì)胞PERK通路的作用，結(jié)果表明人參皂苷Rg3通過PERK、elF2α磷酸化，增加了下游蛋白ATF4、Lcn2表達(dá)，證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路的激活，并發(fā)揮抗腫瘤作用。

表1 兩組裸鼠移植瘤體積與瘤體質(zhì)量比較

表2 兩組裸鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

圖1 兩組裸鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

近年研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路活化能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[9-11]。PERK通路是未折疊蛋白反應(yīng)信號通路的一個組成部分。在非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，PERK與分子伴侶GRP78/Bip結(jié)合處于非活動狀態(tài)；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，PERK與GRP78/BiP分離并被激活，PERK磷酸化后引起eIF2α失活，使細(xì)胞多數(shù)蛋白質(zhì)的合成終止，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。PERK、eIF2α磷酸化同時激活A(yù)TF4，上調(diào)CHOP表達(dá)[12]。ATF4是堿性亮氨酸拉鏈家族的成員之一，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下依賴PERK通路翻譯，在綜合應(yīng)激反應(yīng)通路的激活中起核心作用。在應(yīng)激源作用下，eIF2α磷酸化后使ATF4進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活下游基因表達(dá)[13]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的報(bào)道中均發(fā)現(xiàn)ATF4表達(dá)上調(diào)[14]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一個特定轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白——細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因表達(dá)，與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)[15]。此外，各類促細(xì)胞凋亡的研究中已有CHOP表達(dá)增加的相關(guān)報(bào)道[16]。

Lcn2也稱為中性粒細(xì)胞明膠酶蛋白，在多種實(shí)體腫瘤中均有表達(dá)上調(diào)，并被證明與腫瘤進(jìn)展相關(guān)[17-19]。研究表明在前列腺癌細(xì)胞中未折疊蛋白反應(yīng)通過NF-κB依賴途徑激活Lcn2表達(dá)，Lcn2在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)可能伴隨未折疊蛋白翻譯活化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/Lcn2可能是腫瘤發(fā)展過程中的一個潛在干預(yù)靶點(diǎn)[20]。另有研究表明在慢性腎功能不全時清蛋白通過升高胞質(zhì)內(nèi)鈣濃度，誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)，通過ATF4、Lcn2表達(dá)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡；同時，Lcn2基因抑制能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減輕蛋白尿小鼠的腎小管間質(zhì)損傷，降低死亡率[21]。本研究也得出類似結(jié)果，人膽囊癌裸鼠移植瘤經(jīng)人參皂苷Rg3處理后Lcn2蛋白表達(dá)顯著升高。

本研究表明人參皂苷Rg3灌胃能明顯抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤的生長，同時人參皂苷Rg3沒有增加PERK和eIF2α蛋白表達(dá)。人參皂苷Rg3灌胃組p-PERK、peIF2α、ATF4和Lcn2蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組，表明人參皂苷Rg3能引起PERK、eIF2α磷酸化并增加ATF4、Lcn2蛋白表達(dá)，證實(shí)人參皂苷Rg3在體內(nèi)激活PERK通路的重要作用，人參皂苷Rg3在體內(nèi)通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路，抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤生長。人參皂苷Rg3可以作為有前景的抗膽囊癌藥物進(jìn)一步研究，而人參皂苷Rg3促膽囊癌細(xì)胞凋亡的其他機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。