基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的益母草作用機(jī)制分析

李從林 王博龍

摘要：目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究益母草主要活性成分及藥理機(jī)制，為新藥研發(fā)提供參考。方法 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）收錄的益母草化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選活性成分，并找出活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。構(gòu)建益母草活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），運(yùn)用DAVID平臺(tái)進(jìn)行靶點(diǎn)GO功能富集和KEGG信號(hào)通路富集。結(jié)果 發(fā)掘益母草主要活性成分14種，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)216個(gè)（包括5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、TP53、IL-6、CALM2、JUN），參與生物過(guò)程509個(gè)。KEGG關(guān)鍵通路包括催產(chǎn)素信號(hào)通路、補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、血小板活化、TNF信號(hào)通路等。結(jié)論 本研究初步揭示了益母草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及多維藥理作用，可為益母草開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞：益母草；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；蛋白互作；信號(hào)通路；靶點(diǎn)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.024

中圖分類號(hào)：R2-05；R285 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）12-0102-05

Abstract： Objective To study the main active components and pharmacological mechanism of Leonuri Herba based on the network pharmacology； To provide references for research and development of new medicine. Methods Chemical components of Leonuri Herba from the TCMSP database platform were retrieved. The active components were screened by oral bioavailability （OB） ≥ 30% and drug-like （DL） ≥ 0.18， and the corresponding targets of active components were identified. Active components target network and target protein-protein interaction network were constructed， and DAVID platform was used for target GO function enrichment and KEGG signal pathway enrichment analysis. Results Totally 14 main active components and 216 corresponding targets were explored from Leonuri Herba， involving 5 key targets of AKT1， TP53， IL-6， CALM2 and JUN， and participated in 509 biological processes. The key pathways of KEGG included oxytocin signaling pathways， complement and clotting cascades， platelet activation and TNF signaling pathways. Conclusion The material basis and multi-dimensional pharmacological action of Leonuri Herba were preliminarily revealed， which provides basis for its development and utilization.

Keywords： Leonuri Herba； network pharmacology； protein-protein interaction； signal pathway； target

益母草為唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的新鮮或干燥地上部分，具有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫、清熱解毒功效，常用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)閉經(jīng)、惡露不盡、水腫尿少、瘡瘍腫毒[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分主要包括生物堿類、揮發(fā)油類、黃酮類、二萜類等[2]，具有降低血液黏度、保護(hù)心肌、抗氧化、抗炎等藥理活性[3]。然而，其具體的活性物質(zhì)基礎(chǔ)及產(chǎn)生藥理作用的分子機(jī)制尚不明確。

中藥多成分、多靶點(diǎn)、低選擇協(xié)同作用的特點(diǎn)是以線性研究為主的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)面臨的難題。王永炎院士提出中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)是復(fù)雜化學(xué)體系，而生物機(jī)體也是復(fù)雜生命系統(tǒng)，中藥產(chǎn)品化學(xué)物質(zhì)實(shí)體與機(jī)體生物活動(dòng)的交互規(guī)律研究成為中藥現(xiàn)代研究的重要切入點(diǎn)。相關(guān)研究必須采取整合策略，以多學(xué)科交叉、融合為基礎(chǔ)，構(gòu)建新的研究體系。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了藥學(xué)、生物學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)及復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的新技術(shù)與新成果，從化合物、靶點(diǎn)、信號(hào)通路等多角度入手，實(shí)現(xiàn)中藥研究的綜合網(wǎng)絡(luò)分析，在預(yù)測(cè)和辨識(shí)中藥活性成分群及作用靶點(diǎn)、闡明作用機(jī)制、解釋組方規(guī)律、發(fā)現(xiàn)新適應(yīng)癥及新活性化合物等方面，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和巨大潛力。該方法的整體性、系統(tǒng)性切合中藥復(fù)雜體系的特點(diǎn)，已在腦心通膠囊、龍血竭腸溶片、冠心靜膠囊等中藥大品種二次開發(fā)的質(zhì)量控制、作用機(jī)制、臨床方面得到應(yīng)用[4-6]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析益母草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，為其開發(fā)利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點(diǎn)篩選

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp. nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“益母草”為關(guān)鍵詞檢索其活性成分及靶點(diǎn)?？诜锢枚龋╫ral bioavailability，OB）反映化合物的吸收程度，類藥性（drug-like，DL）為化合物與已知藥物的相似性，二者在化合物成藥性評(píng)價(jià)中起關(guān)鍵作用[7]，本研究以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選出候選成分，并挖掘文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充一些重要化學(xué)成分。

1.2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的益母草活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/uploadlists/）翻譯成相應(yīng)基因。再將化合物及相應(yīng)基因?qū)隒ytoscape3.4.0軟件，繪制益母草活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。度值反映網(wǎng)絡(luò)中某節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)目，介數(shù)是網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中經(jīng)過(guò)該節(jié)點(diǎn)的路徑的數(shù)目與最短路徑總數(shù)的比，度值和介數(shù)是量化1個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性的重要拓?fù)鋮?shù)。

1.3 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明確益母草潛在靶蛋白之間的相互作用，將篩選得到的靶蛋白在STRING平臺(tái)（https：//string-db. org/）構(gòu)建蛋靶白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens（人類）”進(jìn)行操作，最低相互作用閾值設(shè)為“medium confidence”（中等），其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。將PPI網(wǎng)絡(luò)模型導(dǎo)入Cytoscape3.5.1軟件，運(yùn)用“Network Analysis”功能進(jìn)行分析研究。依據(jù)度值、介數(shù)確定益母草關(guān)鍵靶蛋白。

1.4 KEGG信號(hào)通路與GO生物過(guò)程富集分析

將得到的潛在靶點(diǎn)在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析和GO生物過(guò)程富集分析，以P<0.05進(jìn)行靶基因篩選，分析益母草發(fā)揮藥理作用的主要信號(hào)通路及生物過(guò)程。

2 結(jié)果

2.1 主要活性成分信息

篩選出益母草主要活性成分8種，由于益母草寧堿等6種成分具有明顯藥理活性[8-9]，故一并納入活性成分研究，共得到14種主要活性成分，見表1。

2.2 主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

益母草主要活性成分網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)見表2，主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖1。

2.3 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中包含212個(gè)節(jié)點(diǎn)（4個(gè)靶蛋白未參與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建）、3387條相互作用連線。該網(wǎng)絡(luò)平均度值為58.5，平均介數(shù)為0.036 2，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，共篩選出5個(gè)度值和介數(shù)均高于平均值的關(guān)鍵靶蛋白（AKT1、TP53、IL-6、CALM2、JUN），提示這些蛋白在益母草藥理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，見圖2。

2.4 GO生物過(guò)程富集結(jié)果

對(duì)益母草216個(gè)靶基因進(jìn)行GO生物過(guò)程富集，篩選到P<0.05的GO條目509個(gè)，按照P值由小到大排列的前20條主要生物過(guò)程見表3。主要涉及對(duì)體內(nèi)外多種有機(jī)、無(wú)機(jī)物的反應(yīng)，對(duì)缺氧的反應(yīng)，細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)節(jié)，細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)，一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)節(jié)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

2.5 KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果

對(duì)益母草216個(gè)蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集，篩選出P<0.05的信號(hào)通路共7大類26條，按照P值由小到大排列，結(jié)果見表4。癌癥相關(guān)通路6條：癌癥的途徑、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、癌癥中的蛋白聚糖、癌癥中的膽堿代謝；循環(huán)系統(tǒng)信號(hào)通路3條：補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、血小板激活、血管平滑肌收縮；糖尿病相關(guān)通路3條：胰島素抵抗、II型糖尿病、I型糖尿?。谎装Y相關(guān)通路4條：TNF信號(hào)通路、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)控、Fcγ-R信號(hào)調(diào)理的吞噬、NF-κβ信號(hào)通路；5條信號(hào)通路：PI3K-Akt信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路；神經(jīng)遞質(zhì)通路2條：5-羥色胺能突觸、膽堿能突觸；脂代謝通路2條：脂肪細(xì)胞因子信號(hào)傳遞途徑、脂肪細(xì)胞中脂解的調(diào)節(jié)。涉及癌癥、糖尿病、心血管疾病、炎癥等。

3 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出益母草主要活性成分14種及靶點(diǎn)216個(gè)，KEGG分析顯示靶基因主要分布于心血管、炎癥、糖尿病、癌癥等7大類26條通路。PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)與多種復(fù)雜疾病緊密相關(guān)的靶點(diǎn)，如AKT1編碼的AKT蛋白。AKT是細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路中的傳感器，在生長(zhǎng)因子或胰島素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要的角色，在營(yíng)養(yǎng)代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞存活中也具有重要作用[10]?？梢娨婺覆莸乃幚碜饔秒x不開這些關(guān)鍵靶蛋白的直接或者間接作用。

益母草有“血家圣藥”“經(jīng)產(chǎn)良藥”之稱，活血化瘀作用明顯，其萜類活性成分能改變血液流變學(xué)、改善微循環(huán)、心肌缺血、抗血栓[11-13]，這與本研究KEGG富集分析得出的益母草靶點(diǎn)可富集在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、血小板活化、血管平滑肌收縮等信號(hào)通路的結(jié)果相吻合。除影響血管平滑肌收縮外，益母草對(duì)子宮平滑肌具雙向調(diào)節(jié)作用，如在產(chǎn)后出血中可聯(lián)合縮宮素增強(qiáng)子宮收縮表現(xiàn)為止血作用[14-16]，而應(yīng)用于痛經(jīng)等疾病中則抑制子宮平滑肌收縮[17]。本研究發(fā)現(xiàn)益母草中鼬瓣花二萜、別香橙稀、前益母草二萜、異前益母草二萜、β-蓽澄茄油烯、植醇、山柰酚、石竹素等成分能作用M1、M2、M3膽堿能受體。KEGG富集結(jié)果也有催產(chǎn)素信號(hào)通路、膽堿能突觸信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等決定子宮平滑肌收縮的主要通路。

本研究還發(fā)現(xiàn)，TNF信號(hào)通路、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)控、Fcγ-R信號(hào)調(diào)理的吞噬、NF-κβ信號(hào)通路等炎癥方面通路，說(shuō)明益母草中含有抗炎類化合物。王麗娟等[18]采用小鼠熱板法和化學(xué)刺激法等發(fā)現(xiàn)益母草具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎作用。其中萜類化合物通過(guò)作用于NF-κβ信號(hào)通路，下調(diào)一氧化氮合酶和環(huán)氧化酶蛋白質(zhì)表達(dá)，致使脂多糖誘導(dǎo)的一氧化氮和前列腺素E2生成減少[19]。益母草中黃酮類物質(zhì)也具有顯著的抗炎作用，能夠抑制肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞釋放慢反應(yīng)致炎物質(zhì)[20]。

此外，本研究益母草靶基因KEGG富集還得到多條癌癥、糖尿病密切相關(guān)通路。宋霏[21]發(fā)現(xiàn)益母草水提物及益母草醇提物對(duì)人宮頸癌具有一定的體外抗腫瘤活性。而降糖作用未見報(bào)道，相關(guān)研究均處于探索階段。

益母草成分復(fù)雜，藥理作用多樣，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，初步分析其在血栓性疾病、婦產(chǎn)科疾病、炎癥等方面的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為中藥研究的一種新方法，離不開相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和技術(shù)手段的完善，而中藥成分的發(fā)現(xiàn)也需要積累，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)資料的完整性、準(zhǔn)確性及實(shí)時(shí)更新等有待進(jìn)一步加強(qiáng)。本研究單純從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度推測(cè)了益母草主要活性成分及藥理機(jī)制，未將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，存在一定局限性，部分結(jié)論尤其是新發(fā)現(xiàn)抗癌及降糖作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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