草麻黃HPLC特征圖譜研究

孫云波 沈碩 宋聯(lián)強 張創(chuàng)峰 田清存 崔旭盛 畢丹

摘要：目的 建立草麻黃的HPLC特征圖譜，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。方法 采用RP-HPLC，色譜柱為Waters XBridgeTM Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 ?m），以甲醇-0.092%磷酸（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）為流動相，梯度洗脫，0～14 min流速為0.8 mL/min，21～60 min流速為1.0 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進樣體積為10 ?L，記錄時間為60 min。結(jié)果 HPLC特征圖譜的方法學(xué)考察結(jié)果符合要求，共標(biāo)定草麻黃HPLC特征圖譜的9個特征峰，指認(rèn)其中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和鹽酸甲基麻黃堿3個特征峰，10批草麻黃特征圖譜的相似度為0.861～0.982。結(jié)論 本研究建立的草麻黃HPLC特征圖譜可為草麻黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：草麻黃；高效液相色譜法；特征圖譜；鹽酸麻黃堿；相似度分析；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.017

中圖分類號：R284.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）12-0067-04

Abstract： Objective To establish an HPLC specific chromatograms of Ephedra sinica Stapf. and to provide a basis for establishment of quality standards of Ephedra sinica Stapf. Methods The RP-HPLC method were adopted， with Waters XBridgeTM phenyl （250 mm × 4.6 mm， 5 ?m） as the chromatographic column. Methanol and water containing 0.092% phosphoric acid， 0.04% triethylamine and 0.02% dibutylamine was as the mobile phase for gradient elution. Flow rate of 0–14 min was 0.8 mL/min； flow rate of 21–60 min was 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 210 nm. The column temperature was 30 ℃. The sample volume was 10 ?L. The recording time was 60 min. Results The methodological study of HPLC specific chromatograms met relevant requirements. A total of nine characteristic peaks of HPLC specific chromatograms of Ephedra sinica Stapf. were marked， and three characteristic peaks of ephedrine hydrochloride， pseudoephedrine hydrochloride and methylephedrine hydrochloride were identified. Similarities of 10 batches of Ephedra sinica Stapf. were among 0.861–0.982. Conclusion The HPLC specific chromatograms of Ephedra sinica Stapf. can provide a basis for establishment of quality standards of Ephedra sinica Stapf..

Keywords： Ephedra sinica Stapf.； HPLC； specific chromatograms； ephedrine hydrochloride； similarity analysis； quality standards

草麻黃Ephedra sinica Stapf.為麻黃科植物，是《中華人民共和國藥典》收載的中藥麻黃的基源植物之一，與中麻黃Ephedra intertmedia Schrenk et C.A. Mey.和木賊麻黃Ephedra equisetina Bge.均為法定正品藥用麻黃[1]。麻黃性溫，味辛、微苦，功效發(fā)汗解表、利水消腫、宣肺平喘，具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、松弛支氣管平滑肌、免疫抑制、抗氧化、抗凝血、抗病毒及抗癌、預(yù)防肥胖等作用[2-4]。2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.8%作為麻黃質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)[1]。但麻黃化學(xué)成分復(fù)雜，含有生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油、有機酚酸類、糖類及鞣質(zhì)、單萜糖苷類、木質(zhì)素類等多種化學(xué)成分[3-8]，藥理作用豐富[7-11]。中藥的藥效作用是其所含多種成分共同作用的結(jié)果，因此僅對上述2種生物堿成分進行定量分析，不能從整體上反映麻黃藥材的內(nèi)在質(zhì)量。

中藥指紋圖譜技術(shù)作為一種從整體上控制中藥質(zhì)量的手段，已得到廣泛應(yīng)用，該技術(shù)能很好地反映色譜峰信息量較大的中藥質(zhì)量，而特征圖譜則能更好地反映色譜峰信息量相對較少的中藥質(zhì)量。中藥特征圖譜具有分析速度快、分離效能高、應(yīng)用設(shè)備普遍的優(yōu)點，是目前應(yīng)用最多的一種快速檢驗藥材質(zhì)量的技術(shù)。草麻黃主產(chǎn)地資源豐富，采收較容易，資源易得到保證。本研究對道地產(chǎn)區(qū)草麻黃進行質(zhì)量控制研究，由于草麻黃色譜峰信息量較小，故采用HPLC進行特征圖譜研究，旨在建立草麻黃特征圖譜，以有效控制草麻黃藥材質(zhì)量，促進道地產(chǎn)區(qū)草麻黃藥材生產(chǎn)穩(wěn)定發(fā)展。

1 儀器與試藥

Agilent Technologies 1260 series分析型高效液相色譜儀（DAD檢測器、柱溫箱、自動進樣器、色譜工作站），美國安捷倫科技有限公司；AL204型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；AB135-S型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；KQ250DB型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Waters XbridgeTM Phenyl色譜柱（5 ?m，4.6 mm×250 mm）。

鹽酸麻黃堿對照品（純度99.7%，批號171241- 201007）、鹽酸偽麻黃堿對照品（純度99.9%，批號171237-201208）、鹽酸甲基麻黃堿對照品（純度99.7%，批號171247-200301），中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純），美國Fisher公司；磷酸、三乙胺、二正丁胺均為分析純，水為超純水（Milli-Q制備）；0.45 ?m微孔濾膜，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司。10批草麻黃藥材經(jīng)石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司中藥資源部田清存主任鑒定為草麻黃Ephedra sinica Stapf.，樣本存放于北京以嶺藥業(yè)有限公司，樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters XbridgeTM Phenyl色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為甲醇（A）-0.092%磷酸（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺，B），梯度洗脫（見表2），柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，進樣量10 ?L。

2.2 供試品溶液的制備

取草麻黃粉末（過5號篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.5%磷酸25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用1.5%磷酸補足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿對照品適量，精密稱定，加1.5%磷酸制成40 ?g/mL的對照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗

取同一份草麻黃（S7號）供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按“2.1”項下色譜條件測定，將所得色譜圖導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，以5號峰為參照峰（S）計算，各特征峰的相對保留時間RSD均小于0.98%，相對峰面積RSD均小于2.88%，所得色譜圖的9個特征峰相似度分別為0.995、0.996、0.996、0.996、0.997、0.987，RSD=0.38%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取同一份草麻黃（編號S7）供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、24 h進樣測定，以5號峰為參照峰（S）計算，各特征峰的相對保留時間RSD均小于1.29%，相對峰面積RSD均小于2.82%，所得的色譜圖的9個特征峰相似度分別為0.994、0.997、0.997、0.997、0.997、0.994、0.996，RSD=0.14%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗

取同一批草麻黃（編號S7），按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，以5號峰為參照峰（S）計算，各特征峰的相對保留時間RSD均小于0.11%，相對峰面積RSD均小于2.68%，所得色譜圖的9個特征峰相似度分別為0.996、0.999、1.000、1.000、0.999、1.000，RSD=0.16%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 特征圖譜的建立及分析

取10批草麻黃粉末（過5號篩），分別按“2.2”“2.3”項下方法制備供試品溶液和對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖（見圖1）。共標(biāo)定草麻黃HPLC特征圖譜的9個特征峰，將供試品溶液與對照品溶液色譜峰的保留時間及紫外吸收光譜圖進行比對，指認(rèn)了其中3個色譜峰，分別為鹽酸麻黃堿（5號峰）、鹽酸偽麻黃堿（6號峰）和鹽酸甲基麻黃堿（7號峰）。將所得10批草麻黃樣品的HPLC特征圖譜以AIA格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，選定S7號樣品的色譜圖為參照圖譜，設(shè)定時間漂移值為0.1，采用中位數(shù)法譜峰自動匹配，進行多點矯正，得到10批草麻黃樣品疊加圖譜及對照圖譜（見圖2）。將生成的對照圖譜（R）的相似度定為1，計算草麻黃樣品特征圖譜的相似度，結(jié)果其相似度為0.861～0.982，見表3。以5號峰鹽酸麻黃堿為參照峰（S），計算各特征峰與S峰的相對保留時間，結(jié)果見表4。將相對保留時間的平均值作為規(guī)定值，9個共有峰相對保留時間均在規(guī)定值±5%范圍內(nèi)。

3 討論

本試驗采用HPLC-DAD檢測器進行全波長掃描，比較190～400 nm所得的特征圖譜，結(jié)果在210 nm檢測的色譜圖中色譜峰最多，因此確定檢測波長為210 nm。試驗考察了不同色譜柱溫度（25、30、35 ℃）所得的特征圖譜，結(jié)果表明色譜柱溫度為30 ℃時，色譜圖中色譜峰數(shù)量最多且分離效果最好。

本試驗比較了不同的流動相，如甲醇-0.2%磷酸、甲醇-水、甲醇-0.092%磷酸（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）、乙腈-0.2%磷酸，結(jié)果顯示甲醇-0.092%磷酸（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）的分離效果較好，故以此為流動相進行梯度洗脫。在該色譜條件下增加有機相梯度洗脫比例，并延長洗脫時間至120 min，結(jié)果表明60 min后沒有明顯的色譜峰，因此流動相洗脫時間確定為60 min，方法學(xué)考察驗證了該色譜條件的可行性。因此，該色譜條件可用于建立草麻黃HPLC特征圖譜。

本試驗比較了不同提取溶劑，如水、1.5%磷酸、50%甲醇、50%甲醇（含1.5%磷酸）、甲醇、甲醇（含1.5%磷酸），結(jié)果表明1.5%磷酸作為提取溶劑所得的特征圖譜中色譜峰最多、峰面積較大，因此選擇1.5%磷酸作為提取溶劑。本試驗還考察了加熱回流和超聲法2種提取方法，結(jié)果表明2種方法所得特征圖譜色譜峰的強度與數(shù)目無明顯差異，而超聲提取方法簡便，因此選擇超聲提取。同時，比較了超聲提取20、30、40 min的效果，結(jié)果表明超聲提取30、40 min所得特征圖譜中色譜峰數(shù)量較超聲提取20 min多，且提取30 min和40 min所得特征圖譜的色譜峰無明顯差異，因此最終確定超聲提取時間為30 min。

本試驗采用HPLC-DAD梯度洗脫建立了草麻黃特征圖譜的分析方法，同時對色譜條件和供試品溶液的制備方法進行了優(yōu)化，并進行了方法學(xué)考察，結(jié)果顯示精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性相對保留時間的RSD均小于2%，相對峰面積的RSD均小于3%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性良好。測定10批草麻黃的HPLC特征圖譜，運用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件進行分析，得到9個共有峰。比較10批草麻黃HPLC特征圖譜中特征峰的相對保留時間，并計算相似度，結(jié)果表明不同批次草麻黃HPLC特征圖譜的特征峰相對保留時間在規(guī)定值范圍內(nèi)，相似度為0.861～0.982，10批草麻黃有較好的相似度。

本研究建立了草麻黃藥材特征圖譜檢測方法，并對不同批次草麻黃藥材特征圖譜進行分析比較，為草麻黃藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及鑒別提供了依據(jù)。

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