扶正解毒化瘀方總苷提取物對呼吸道合胞病毒感染宿主細胞炎性反應的影響

程淼 王明哲 宋金華 董曉旭 楊春靜 王成祥

摘要：目的 觀察扶正解毒化瘀方總苷提取物對呼吸道合胞病毒（RSV）感染HEp-2細胞Toll樣受體（TLRs）相關細胞炎性因子的影響，探討其可能的作用機制。方法 建立RSV感染HEp-2細胞模型，隨機分為病毒對照組、總苷提取物組及利巴韋林組，各給藥組給予相應藥物，同時以未感染RSV的HEp-2細胞作為空白對照。應用液相色譜-質譜分析扶正解毒化瘀方全方、總苷提取物及其藥物血清的主要成分。采用ELISA檢測細胞上清液白細胞介素（IL）-1β、IL-8、干擾素-α（IFN-α）、TLR3、TLR7水平。結果 扶正解毒化瘀方全方提取物共鑒別出10個化學成分，以苷類為主。扶正解毒化瘀方總苷提取物共鑒別出9個化學成分，其中入血成分共鑒別出8個化學成分，包括芍藥苷、木犀草素、野黃芩苷、連翹酯苷H、異葒草苷、連翹苷、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re。與HEp-2細胞組比較，病毒對照組感染后24、48、72 h IFN-α、IL-1β、IL-8、TLR3和TLR7水平均升高；與病毒對照組比較，總苷提取物組感染后24、48、72 h IFN-α、IL-1β、IL-8、TLR3和TLR7水平均降低。結論 扶正解毒化瘀方總苷提取物可能通過調(diào)節(jié)TLRs相關細胞炎性因子，抑制細胞炎性反應起到治療RSV肺炎的作用。

關鍵詞：呼吸道合胞病毒；扶正解毒化瘀方總苷提取物；液相色譜-質譜分析；Toll樣受體；細胞因子；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.010

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）12-0035-05

Abstract： Objective To observe the effects of total glycoside extracts of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on related cytokines in HEp-2 cells infected by respiratory syncytial virus （RSV）； To discuss the possible mechanism of action. Methods RSV infection HEp-2 cell model was established and randomly divided into virus control group， total glycoside extracts group and Ribavirin group. Each administration group was given relevant medicine， and at the same time， HEp-2 cells not infected with RSV were set as blank controls. The main components of prescription， total glycosides extracts and serum of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry. The levels of IL-1β， IL-8， IFN-α， TLR3 and TLR7 in cell supernatant were detected by ELISA.Results Totally 10 chemical constituents were identified from total extracts of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction， while glycoside as the most common component. 9 chemical constituents were identified from the total glucoside extracts of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction， while paeoniflorin， luteolin， scutellarin， forsythoside H， isopolygonarin， forsythin， ginsenoside Rb1 and ginsenoside Re were identified in the composition of the blood. Compared with HEp-2 cell group， IL-1β， IFN-α， TLR3 and TLR7 increased in the virus control model group when the HEp-2 cell group was infected after 24， 48 and 72 h. Compared with virus control group， IL-1β， IFN-α， TLR3 and TLR7 were reduced in different degrees in total glycoside extracts group when total glycoside extracts group was infected after 24， 48 and 72 h. Conclusion Total glycoside extracts of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction may play a role in the treatment of RSV pneumonia by regulating TLRs-associated cytokines and inhibiting cellular inflammatory responses.

Keywords： RSV； total glucoside extracts of Fuzheng Jiedu Huayu Decotion； liquid chromatography-mass spectrometry analysis； Toll-like receptor； cytokine； rats

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是一種RNA病毒，分布廣且有傳染性，可致肺炎，是引起嬰幼兒、老年人及免疫缺陷者下呼吸道感染的重要病原之一。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是近來發(fā)現(xiàn)并廣泛研究的一類先天性免疫受體家族，是免疫系統(tǒng)抵抗病原微生物感染的天然受體。TLRs通過識別細菌、病毒等不同病原相關分子模式，在啟動先天性免疫反應中起著核心作用，也能調(diào)節(jié)獲得性免疫。RSV感染時，其致病性與破壞氣道上皮細胞有關，更與其感染后引發(fā)的機體免疫反應有關。目前缺乏專屬性強的治療RSV藥物，且尚無美國食品藥品管理局批準用于預防RSV的疫苗。前期課題研究顯示，扶正解毒化瘀方對多種病原體所致肺炎有較好療效[1]，但作用機制尚不清楚。扶正解毒化瘀方由黃芩、連翹、漏蘆等組成，其化學成分包括黃芩苷、連翹苷、人參皂苷、敗醬草苷、芍藥苷等，苷類化合物在該方中所占比例較大。本實驗采用液相色譜-質譜法對扶正解毒化瘀方全方和總苷提取物入血成分進行分析，并對該方總苷提取物抗RSV的作用機制進行初步研究。

1 實驗材料

1.1 動物

SD雄性大鼠60只，SPF級，體質量（200±10）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所實驗動物房。

1.2 病毒和細胞株

RSV-A型、人喉癌細胞（HEp-2），中國疾病控制中心病毒病預防控制所提供。

1.3 藥物

扶正解毒化瘀方（西洋參6 g，黃芩15 g，連翹15 g，漏蘆15 g，敗醬草30 g，瓜蔞30 g，赤芍15 g，薏苡仁30 g），飲片由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中藥房提供，符合2015年版《中華人民共和國藥典》質量控制標準。利巴韋林注射液，天津藥業(yè)焦作有限公司，每支100 mg/mL，批號10092411。

1.4 主要試劑與儀器

鼠TLR-3、TLR-7、干擾素-α（IFN-α）Blue Gene（欣博盛生物科技有限公司），鼠IL-1β、IL-8 Blue Gene（聯(lián)科生物技術有限公司）。CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo），恒溫水浴箱（北京長風），ⅡB級生物安全柜SCV1303EO（日本HITACHI），HC-3018R高速冷凍離心機（中科中佳公司），全自動多功能酶標儀（美國Thermo），電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司），高分辨串聯(lián)質譜儀（美國Thermo），XP26型電子天平（METTLER TOLEDO），3K15型冷凍高速離心機（Sigma），移液槍（Gilson），XW-80A渦旋儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）。

2 實驗方法

2.1 藥物和藥物血清制備

扶正解毒化瘀方提取物制備：參考藥物臨床用藥方式，采取全方水煎煮制備工藝。全方飲片按量稱取后，置提取罐中，加10倍量水煎煮2次，每次1.5 h，過濾，收集濾液，減壓濃縮，干燥，粉碎，即得。全方提取物粉末每克相當于原藥材4.2 g，根據(jù)實驗所需劑量，用蒸餾水配制成濃度為0.28 g/mL藥液。扶正解毒化瘀方總苷提取物制備：參考藥物臨床用藥方式和藥物成分性質，采取全方水煮醇沉制備工藝。全方飲片按量稱取后，置提取罐中，加10倍量水煎煮2次，每次1.5 h，過濾，收集濾液，減壓濃縮至相對密度1.10～1.15（60 ℃），緩慢加入乙醇至含醇量60%，冷置12 h，過濾，收集濾液，減壓濃縮，減壓干燥，粉碎，即得?？傑仗崛∥锩靠讼喈斢谠幉?.5 g，根據(jù)實驗所需劑量，用蒸餾水配制成濃度為0.18 g/mL藥液。藥物血清制備：取SD大鼠，雌雄各半，適應性喂養(yǎng)1周，分為空白對照組、全方提取物組和總苷提取物組，每組10只。全方提取物和總苷提取物終濃度分別為0.75、0.48 g/mL，按人與大鼠體表面積換算公式計算灌胃量，按1 mL/100 g灌胃，空白對照組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)3 d，大鼠末次灌胃給藥2 h后取血，37 ℃水浴，2000 r/min離心5 min，分離血清，以0.22 μm無菌濾器過濾，置于-20 ℃冰箱保存，臨用以DMEM培養(yǎng)液配制。

2.2 病毒滴定

參照文獻[2]方法進行病毒培養(yǎng)和滴定，按Karber公式計算RSV對HEp-2細胞TCID50滴度，實驗所用RSV病毒滴度為10-4 TCID50/0.1 mL。

2.3 HEp-2細胞毒性檢測

細胞培養(yǎng)和實驗藥物（扶正解毒化瘀方總苷提取物和利巴韋林）對HEp-2細胞毒性實驗具體操作參考文獻[3]，確定扶正解毒化瘀方總苷提取物和利巴韋林最大無毒劑量分別為0.509 mg/mL和0.078 mg/mL。

2.4 分組及給藥

將HEp-2細胞接種于1 mL細胞培養(yǎng)管，培養(yǎng)至單層，棄掉培養(yǎng)液，分為HEp-2細胞組、病毒對照組、總苷提取物組及利巴韋林組。除HEp-2細胞對照組外其他3組加入100 TCID50 RSV稀釋液，37 ℃、5%CO2吸附1 h，棄掉病毒液，給藥組分別加入0.509 mg/mL扶正解毒化瘀方總苷提取物和0.078 mg/mL利巴韋林，每管200 mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

2.5 液相色譜-質譜分析

精密稱取總苷提取物及有效部位干膏各10 mg，分別置1.5 mL離心管中，加入10%甲醇1 mL，超聲使藥物完全溶解，制得總苷提取物及有效部位濃度均為10 mg/mL，取適量，過0.25 μm針孔濾器，注入液相瓶，進樣10 μL，進行LC-MS/MS測定，平行3份。

精密吸取給藥前后血漿樣品100 μL，加乙腈沉淀蛋白1 mL，渦旋3 min，14 000 r/min離心20 min，移取有機層，氮氣吹干，殘渣加100 μL甲醇復溶，渦旋2 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液置于液相瓶，進樣10 μL，行LC-MS/MS測定，平行3份。

色譜條件：采用ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.2 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：0.1%甲酸水-甲醇；運行時間：0～45 min；分辨率：70 000；最大離子注入時間：150 ms；掃描范圍：100～1500 m/z陰性。

2.6 細胞炎性因子檢測

采用ELISA檢測各實驗組細胞上清液炎性因子IL-1β、IL-8、IFN-α、TLR3、TLR7的表達。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 液相色譜-質譜分析結果

扶正解毒化瘀方全方提取物共鑒別出10個化學成分，分別為槲皮素、芍藥苷、木犀草素、野黃芩苷、連翹酯苷H、異葒草苷、連翹苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re。扶正解毒化瘀方總苷提取物共鑒別出9個化學成分，分別為芍藥苷、木犀草素、野黃芩苷、連翹酯苷H、異葒草苷、連翹苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re。扶正解毒化瘀方全方提取物入血成分共鑒別出3個化學成分，分別為芍藥苷、連翹酯苷H、人參皂苷Rb1。扶正解毒化瘀方總苷提取物入血成分共鑒別出8個化學成分，芍藥苷、木犀草素、野黃芩苷、連翹酯苷H、異葒草苷、連翹苷、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re。結果見圖1～圖5。

4.2 扶正解毒化瘀方總苷提取物對呼吸道合胞病毒感染細胞上清液干擾素-α水平的影響

與HEp-2細胞組比較，病毒對照組RSV感染后24、72 h IFN-α水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與病毒對照組比較，總苷提取物組RSV感染后24、48、72 h IFN-α均有所升高，其中RSV感染后48 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果見表1。

4.3 扶正解毒化瘀方總苷提取物對呼吸道合胞病毒感染細胞上清液白細胞介素-1β水平的影響

與HEp-2細胞組比較，病毒對照組RSV感染后24、48、72 h IL-1β均有所升高，其中RSV感染后24、48 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與病毒對照組比較，總苷提取物組RSV感染后24、48、72 h IL-1β均有所降低，其中RSV感染后24、48 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果見表2。

4.4 扶正解毒化瘀方總苷提取物對呼吸道合胞病毒感染細胞上清液白細胞介素-8的影響

與HEp-2細胞組比較，病毒對照組RSV感染后24、48、72 h IL-8均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與病毒對照組比較，總苷提取物組RSV感染后24、48、72 h IL-8均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果見表3。

4.5 扶正解毒化瘀方總苷提取物對呼吸道合胞病毒感染細胞上清液Toll樣受體3、7水平的影響

與HEp-2細胞組比較，病毒對照組RSV感染后24、48、72 h TLR3和TLR7水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與病毒對照組比較，總苷提取物組RSV感染后24、48、72 h TLR3和TLR7水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果見表4、表5。

5 討論

RSV感染是除流感病毒之外最常見的病原體，RSV所致肺炎病情更為嚴重，但在臨床診斷上容易被忽視。RSV感染能誘導氣道上皮細胞產(chǎn)生多種細胞炎性因子，如IL-6、IL-8等[4]，引起細支氣管炎、肺炎等。TLRs單個跨膜非催化性蛋白質可識別來源于微生物具有保守結構的分子，參與非特異性免疫，同時也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。當微生物突破機體的物理屏障，TLR可識別它們并激活機體產(chǎn)生免疫應答[5]。TLR3是識別病毒dsRNA的受體，在抗病毒、阻止病毒復制，保護機體中起重要作用[6]，TLR7識別RSV的負鏈RNA病毒后能介導天然抗病毒反應[7]。先天性免疫是宿主防御病毒感染的第一道天然防線，抗病毒先天性免疫關鍵是機體合成和分泌Ⅰ型干擾素，包括IFN-α和IFN-β。IFN-α/β屬Ⅰ型干擾素，是發(fā)揮早期抗病毒和免疫刺激活性的主要效應分子。細胞抗病毒先天免疫包含宿主模式識別受體，該模式識別入侵病毒并啟動一系列信號事件致Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子的產(chǎn)生[8-9]。

清熱解毒為溫熱病之主要治法，且強調(diào)盡早使用，“邪既入，即以逐穢為第一要務”，針對熱毒熾盛、毒瘀互結、正氣虧虛的核心病機，采用“風淫于內(nèi)，治以辛涼，佐以苦甘”的治則擬定扶正解毒化瘀方藥。本實驗結果顯示，與HEp-2細胞組比較，病毒對照組RSV感染后24、48、72 h IFN-α、IL-1β、IL-8、TLR3和TLR7水平均升高；與病毒對照組比較，總苷提取物組RSV感染后24、48、72 h IFN-α、IL-1β、IL-8、TLR3和TLR7水平均降低。綜上，扶正解毒化瘀方總苷提取物可能通過調(diào)節(jié)TLRs相關細胞炎性因子，抑制細胞炎性反應，而起到治療RSV肺炎的作用。

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