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    基質(zhì)栽培與土壤栽培對越心草莓蔗糖和檸檬酸積累的影響

    2022-07-28 06:47:40楊肖芳李云端孫云帆李紹佳苗立祥張豫超蔣桂華
    浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報 2022年7期
    關(guān)鍵詞:基部檸檬酸蔗糖

    楊肖芳,李云端,孫云帆,李紹佳,苗立祥,張豫超,蔣桂華,*

    (1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,浙江 杭州 310021;2.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江 杭州 310058)

    栽培草莓(×)因其果實酸甜可口、香味濃郁且營養(yǎng)價值高,在世界各地已成為了重要的經(jīng)濟(jì)水果,深受消費者歡迎。果實的酸甜度是草莓品質(zhì)的重要指標(biāo),是影響其經(jīng)濟(jì)價值的主要因素之一。果實中可溶性糖類物質(zhì)主要有3種,即蔗糖、葡萄糖和果糖,不同種類成熟果實中積累的可溶性糖類各不相同,成熟草莓果實中蔗糖含量最高。有機(jī)酸是決定果實酸度的重要因子,而影響草莓果實酸度的有機(jī)酸主要為檸檬酸。因此,探索生產(chǎn)上調(diào)控草莓果實蔗糖和檸檬酸積累的有效手段對于調(diào)控其酸甜度至關(guān)重要。

    參與蔗糖代謝相關(guān)的酶主要包括蔗糖磷酸合酶(SPS)、蔗糖合酶(SUS)和轉(zhuǎn)化酶(IVR)。SPS主要與蔗糖合成相關(guān),大量研究表明,SPS與果實蔗糖含量呈正相關(guān),在蘋果中過表達(dá)基因可顯著提高果實的蔗糖含量。SUS既可催化蔗糖分解,也可參與蔗糖合成。研究表明,在梨等果實發(fā)育過程中產(chǎn)生了2種不同形式的SUS,即SS1和SS2;SS1在未成熟果實中主要起分解蔗糖的作用,在坐果時分解活性最高,SS2則在成熟果實中起積累蔗糖的作用。IVR則將蔗糖不可逆催化水解成葡萄糖和果糖,IVR主要包括細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶(CWIN)、液泡轉(zhuǎn)化酶(VIN)和細(xì)胞質(zhì)(CIN)3類;IVR與蔗糖含量關(guān)系密切,在過表達(dá)CWIN抑制劑基因-番茄植株中,CWIN活性明顯受到抑制,果實中蔗糖含量則顯著上升,達(dá)到野生型果實2倍以上。檸檬酸作為果實中常見有機(jī)酸之一,廣泛存在于各種果實中。線粒體是檸檬酸合成的主要部位。首先,糖在果實細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),形成丙酮酸,脫羧形成乙酰輔酶A(Ac-CoA),CO在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的催化下與磷酸烯醇式丙酮酸反應(yīng)生成草酰乙酸(OAA);然后,OAA與Ac-CoA在檸檬酸合酶(CS)的作用下縮合為檸檬酸。已有研究表明,CS為檸檬酸合成的限速酶,過表達(dá)基因可促進(jìn)檸檬酸的合成。在檸檬酸降解過程中,細(xì)胞質(zhì)順烏頭酸酶(ACO)被認(rèn)為是其降解的關(guān)鍵酶,過表達(dá)的果實檸檬酸含量顯著降低,而缺失則導(dǎo)致果實檸檬酸含量升高。

    目前,盡管蔗糖和檸檬酸的合成通路和分子調(diào)控機(jī)制已經(jīng)得到了較為深入的研究,但是生產(chǎn)實踐中不同栽培條件對草莓果實蔗糖和檸檬酸合成的影響未有報道。本文以栽培草莓越心(בYuexin’)為研究對象,比較基質(zhì)栽培和土壤栽培草莓果實蔗糖和檸檬酸積累差異,利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析蔗糖、檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量差異,為探究差異形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),并為實際生產(chǎn)中通過不同栽培條件調(diào)控草莓品質(zhì)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    八倍體栽培草莓越心由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海寧楊渡科技創(chuàng)新基地提供?;|(zhì)栽培的配方為40%泥炭、20%有機(jī)介質(zhì)、10%蛭石、20%植生基盤材、10%珍珠巖、緩釋肥料(2 kg·m)、基質(zhì)殺菌劑、穩(wěn)定劑,生產(chǎn)廠家均為杭州錦海農(nóng)業(yè)科技有限公司?;|(zhì)的有機(jī)質(zhì)含量為38.7%、全氮27.6 g·kg、有效磷237 mg·kg、有效鉀8 317 mg·kg、電導(dǎo)率(EC)3.27 mS·cm、pH值5.98。土壤的有機(jī)質(zhì)1.62%、全氮1.09 g·kg、有效磷123.23 mg·kg、有效鉀194.57 mg·kg、EC 34 mS·cm、pH值7.08。試驗周期內(nèi)用營養(yǎng)液(EC 0.8 mS·cm,pH值5.8)對草莓進(jìn)行滴灌。

    分別在白果期(white,W)、轉(zhuǎn)色期(turning,T)、半紅期(intermediate red,IR)和全紅期(full red,R)4個發(fā)育階段挑選大小一致且無明顯缺陷的果實進(jìn)行取樣。1.5 h內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇?,除去花萼后將果實平分成尖部和基部,迅速切成小塊,立即在液氮中冷凍,然后在-80 ℃保存?zhèn)溆?。?個果實為1組生物學(xué)重復(fù),每個果實發(fā)育階段取4個生物學(xué)重復(fù)。

    1.2 果實糖酸含量測定

    參考Li等的方法進(jìn)行草莓果實糖酸提取與含量測定。取0.1 g凍于-80 ℃冰箱的草莓果實粉末于1.5 mL離心管中,加入提前放置于-20 ℃預(yù)冷的色譜甲醇1.4 mL,渦旋3次使之充分混勻。將離心管置于70 ℃金屬浴中950 r·min加熱15 min,4 ℃、10 000×離心10 min,將上清液倒入10 mL離心管中,加入750 μL三氯甲烷(-20 ℃)和1.5 mL mili-Q水(4 ℃),渦旋3次,常溫下2 200×離心10 min。離心后,吸取上清液于1.5 mL離心管中,置于-40 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    吸取100 μL上清液加入20 μL內(nèi)標(biāo)核糖醇(20 mg·mL),置于常溫下真空干燥。干燥后加入60 μL現(xiàn)配的20 mg·mL甲氧胺鹽酸鹽(吡啶溶),充分渦旋后37 ℃、950 r·min加熱1.5 h,隨后加入40 μL N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷),同樣條件下金屬浴加熱30 min。

    樣品制備完成后,使用氣相色譜儀(7890N-5975C,安捷倫公司,美國)測定草莓果實糖酸含量。色譜柱為HP-5MS(30 M×0.25 mm×0.25 μm,J & WScientific,F(xiàn)olsom,CA)。用氮氣作為載體,進(jìn)樣口溫度250 ℃。進(jìn)樣量為1 μL,分流比10:1,流量為1 mL·min。升溫程序:100 ℃保持1 min,3 ℃·min升溫至185 ℃,15 ℃·min升至230 ℃,保持1 min。

    1.3 果實RNA提取和cDNA合成

    參考改良的CTAB法提取草莓果實總RNA。使用PrimeScriptRT(TaKaRa,日本)去除RNA樣品中的基因組DNA,隨后用1 μg的RNA按試劑盒操作說明(PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit,TaKaRa,日本)進(jìn)行cDNA第一鏈合成,合成體積20 μL。

    1.4 qRT-PCR分析

    利用草莓基因組數(shù)據(jù)庫獲取蔗糖合酶基因1(gene12940)、2(gene11077),蔗糖磷酸合酶基因1(gene11606)、2(gene22863)、3(gene31122),檸檬酸合酶基因1(gene00583)、2(gene05118)、4(gene26778),順烏頭酸酶基因1(gene14541)、3(gene23775)的CDS序列,利用PrimerPremier5.0設(shè)計引物。對cDNA以1∶10的比例進(jìn)行稀釋,2 μL作為模板進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)總體積20 μL,包含10 μL Ssofast EvaGreen Supermix(Bio-Rad,美國),上下游引物(10 μmol·L)各1 μL,6 μL DEPC水和2 μL稀釋后的cDNA模板。qRT-PCR在CFX96儀器(Bio-Rad)進(jìn)行。qRT-PCR擴(kuò)增程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,45個循環(huán)。

    以413為內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)量的校正,并將土壤栽培和基質(zhì)栽培中全紅期基因的表達(dá)量設(shè)為1,用2法計算果實成熟過程中各基因的相對表達(dá)量。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    采用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和統(tǒng)計分析,使用Graphpad Prism 8軟件作圖。

    表1 實時熒光定量PCR引物序列

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同栽培條件下草莓果實的蔗糖含量

    草莓果實尖部的成熟早于基部,蔗糖的積累是果實成熟的重要性狀之一。因此,把果實分為尖部和基部兩部分進(jìn)行分析。蔗糖含量測定的結(jié)果顯示,蔗糖含量隨草莓果實的發(fā)育不斷增加,在果實完全成熟時其蔗糖含量達(dá)到最大值。土壤栽培的果實尖部蔗糖積累在白果期、轉(zhuǎn)色期、半紅期和全紅期均顯著高于基質(zhì)栽培。在果實基部,除白果期土壤栽培比基質(zhì)栽培高外,其他3個時期2種栽培條件下蔗糖含量均無顯著差異(圖1)。

    A,果實尖部;B,果實基部。W,白果期;T,轉(zhuǎn)色期;IR,半紅期;R,全紅期。下同。

    2.2 不同栽培條件下草莓果實的檸檬酸含量

    在草莓果實發(fā)育過程中,基質(zhì)栽培果實尖部和基部的檸檬酸含量先上升后下降,而土壤栽培的則隨果實的發(fā)育逐步下降(圖2)。土壤栽培果實尖部和基部的檸檬酸含量均顯著高于同一時期基質(zhì)栽培的果實,表明土壤栽培可能較基質(zhì)栽培更有利于檸檬酸的積累。

    A,尖部;B,基部。

    2.3 不同栽培條件下草莓果實蔗糖合成相關(guān)基因的表達(dá)模式

    從圖3可以看出,基質(zhì)栽培條件下,果實尖部1基因在全紅期的表達(dá)量顯著高于土壤栽培。果實基部,土壤栽培條件下2基因在半紅期和全紅期的表達(dá)量顯著高于基質(zhì)栽培。果實尖部和基部,基質(zhì)栽培和土壤栽培條件下3基因在相同發(fā)育時期沒有顯著性差異。在果實尖部,土壤栽培條件下1基因在白果期的表達(dá)量顯著高于基質(zhì)栽培,而在全紅期土壤栽培條件下1基因的表達(dá)量顯著低于基質(zhì)栽培。在果實基部和尖部,土壤栽培條件下果實中2基因的表達(dá)量在白果期均顯著高于基質(zhì)栽培,其他時期均無顯著性差異。進(jìn)一步分析表明,只有2的表達(dá)量在兩種栽培條件的果實中隨發(fā)育呈上升趨勢,且與蔗糖的積累呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)=0.567)(圖4)。這與土壤栽培條件下果實蔗糖含量高于基質(zhì)栽培條件下的果實相一致(圖1)。

    圖3 基質(zhì)栽培和土壤栽培條件下蔗糖合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)模式

    圖4 蔗糖含量與FaSPS2基因相對表達(dá)量的相關(guān)性分析

    2.4 不同栽培條件下檸檬酸降解相關(guān)基因的表達(dá)模式

    從圖5可以看出,隨著果實發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn),與檸檬酸代謝相關(guān)的基因表達(dá)量有不同程度的差異,其中,1和3基因的表達(dá)量在土壤和基質(zhì)栽培條件下有顯著差異。在半紅期,果實基部基質(zhì)栽培的1基因比土壤栽培的表達(dá)量低,其他時期基質(zhì)栽培條件下1、3基因的表達(dá)量都高于土壤栽培。相關(guān)性分析結(jié)果表明,1、3基因的表達(dá)量與檸檬酸的積累呈負(fù)相關(guān)(圖6),這與基質(zhì)栽培條件下果實檸檬酸含量低于土壤栽培條件下的果實相符合(圖2)。基質(zhì)栽培和土壤栽培條件下果實基部1基因表達(dá)量僅在半紅期有顯著差異,其他均無顯著差異。土壤栽培栽培條件下果實尖部2基因表達(dá)量僅在全紅期顯著高于基質(zhì)栽培,果實基部2基因表達(dá)量僅在半紅期顯著高于基質(zhì)栽培。土壤栽培條件下果實基部4基因的表達(dá)量僅在半紅期顯著高于基質(zhì)栽培。

    圖5 基質(zhì)栽培和土壤栽培條件下檸檬酸降解相關(guān)基因的表達(dá)模式

    圖6 檸檬酸含量與FaACO1基因和FaACO3基因相對表達(dá)量的相關(guān)性分析

    3 結(jié)論與討論

    本研究表明,參與蔗糖合成的關(guān)鍵基因2的表達(dá)量與蔗糖的積累呈正相關(guān),與檸檬酸降解相關(guān)的關(guān)鍵基因1、3表達(dá)量與檸檬酸的積累呈負(fù)相關(guān),土壤栽培較基質(zhì)栽培更利于越心草莓積累蔗糖和檸檬酸。

    栽培環(huán)境直接影響植株生長狀況、產(chǎn)量和品質(zhì)。已有研究表明,土壤栽培比基質(zhì)栽培更有利于促進(jìn)草莓植株的生長,果實的品質(zhì)、口感風(fēng)味也較好。分別用土壤和基質(zhì)進(jìn)行羅馬花椰菜栽培時,與基質(zhì)栽培相比,土壤栽培不僅可以提高單果重和產(chǎn)量,還能提高可溶性糖含量。本實驗也得出了類似的結(jié)論,土壤栽培的越心草莓可以比基質(zhì)栽培積累更多的蔗糖和檸檬酸。也有研究表明,基質(zhì)栽培比土壤栽培在品質(zhì)改善方面更有效果。當(dāng)用海島土壤進(jìn)行草莓栽培時,其糖度會低于基質(zhì)栽培?;|(zhì)栽培的番茄能顯著提高凈光合速率,有利于培育壯苗,提高可溶性糖含量,改善糖酸比。導(dǎo)致這些研究結(jié)果不一致的原因,除了作物種類不同外,還有可能與品種特性、栽培環(huán)境的理化特性,以及所含的有效營養(yǎng)元素含量有關(guān)。

    草莓果實中蔗糖分布具有一定的梯度,果實尖部的含量大于基部含量。本研究發(fā)現(xiàn),不同栽培環(huán)境不會改變這一特性。草莓土壤栽培較基質(zhì)栽培顯著提高了蔗糖含量,主要是提高了尖部的蔗糖含量,但兩種栽培方式下果實基部蔗糖含量差異不顯著。1、2、1、2、3等基因在草莓果實蔗糖合成與積累中扮演了重要的角色,然而本研究顯示,這些基因的表達(dá)量并沒有一定的規(guī)律。進(jìn)一步將基因表達(dá)量與糖含量進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),只有2的表達(dá)量在兩種栽培條件的果實中隨發(fā)育呈上升趨勢,且與蔗糖的積累呈正相關(guān)。

    檸檬酸是草莓果實中最重要的有機(jī)酸,與可溶性糖一起決定了果實的主要口感。無論是土壤栽培還是基質(zhì)栽培,果實基部和尖部的檸檬酸含量相差不大。白果后期,隨著果實的發(fā)育檸檬酸逐漸被降解,起作用的基因有1、2、4、1、3等。本研究顯示,白果期草莓的檸檬酸含量最高,隨著果實不斷成熟,檸檬酸含量逐漸降低。在全紅期,土壤栽培的果實檸檬酸含量顯著高于基質(zhì)栽培。由于1、3基因在果實成熟過程中主要負(fù)責(zé)檸檬酸的降解,且與檸檬酸的積累呈負(fù)相關(guān)。因此推測,1、3的表達(dá)量差異可能是引起土壤栽培與基質(zhì)栽培草莓果實檸檬酸含量差異的主要原因。

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