H-ESO-HEC兩親性聚合物的合成及其自組裝納米膠束在疏水性藥物載體中的應用

劉 真 真， 王 興， 郭 延 柱,2

( 1.大連工業(yè)大學 輕工與化學工程學院， 遼寧 大連 116034；2.華南理工大學 制漿造紙工程國家重點實驗室， 廣東 廣州 510640 )

0 引 言

羥乙基纖維素(HEC)是一種白色或淡黃色、無味的粉末狀或纖維狀的含有大量親水基團的非離子型聚合物，具有結構穩(wěn)定、優(yōu)良的水溶性、分散性、羥基含量多、無毒無害性及生物相容性等優(yōu)異的特點，在新型生物質基材料中具有廣泛的應用前景[1-2]。兩親性纖維素聚合物是一類具有特殊分子結構的纖維素高附加值衍生物，其分子結構中同時含有親水性鏈段基團與疏水性鏈段。典型的親水性基團包括羥基、羧基等，疏水性基團包括長碳鏈酯或醚、聚內(nèi)酯等[3]。由于親水基團和疏水基團二者之間存在不相容性，導致兩親性纖維素聚合物在水溶液中可通過自組裝技術形成具有核殼結構的納米膠束，其中內(nèi)核為疏水性，主要由疏水性鏈段通過鏈段間的疏水作用力形成，而外殼為親水性，主要由親水性鏈段通過范德華力和分子間氫鍵相互作用以溶劑化的形式包裹在疏水內(nèi)核外面，可減少外界環(huán)境對疏水性功能分子的接觸，保護疏水性功能分子的自身特性[4-6]。兩親性纖維素聚合物同時具備纖維素的特性，如可進行接枝共聚改性、共混改性等，同時具有生物可降解、生物相容性、廉價等優(yōu)點[7-9]，因此，其自組裝納米膠束在眾多領域具有廣泛的應用前景，如生物材料、生物成像、環(huán)境保護、藥物轉載及傳感等領域[10-11]。

植物油脂是自然界中來源豐富、可再生的天然資源。其中，環(huán)氧大豆油(ESO)作為一種新型的生物基環(huán)保型高附加值的材料，具有良好的熱穩(wěn)定性、疏水性等特點[12-13]。但環(huán)氧大豆油的生產(chǎn)成本的增加，很大程度限制了其應用范圍，因此，提高環(huán)氧大豆油產(chǎn)品的附加值成為目前急需解決的問題。環(huán)氧大豆油分子結構中含有活潑性較強的環(huán)氧基，能夠開環(huán)與聚合物中的羥基等含活潑氫的基團發(fā)生接枝反應[14-17]，因此，可將環(huán)氧大豆油用于對纖維素接枝改性以改善其疏水性能，同時提高環(huán)氧大豆油的生產(chǎn)附加值。

本實驗以HEC和ESO為原料，在無水SnCl4的催化作用下于二甲基亞砜(DMSO)溶液中反應制得ESO-HEC，經(jīng)NaOH水解得到H-ESO-HEC兩親性聚合物。通過改變親水鏈段分子質量和疏水鏈段用量，在水溶液中得到了穩(wěn)定性好的H-ESO-HEC 自組裝納米膠束，對共聚物的自組裝行為進行研究，并初步探索了H-ESO-HEC兩親性共聚物納米膠束對疏水性抗癌藥物的包載效果。

1 實 驗

1.1 原料與試劑

HEC，相對分子質量分別為50 000和20 000，阿拉丁試劑有限公司，使用前于45 ℃真空干燥48 h以徹底除去水分；ESO，相對分子質量約為1 000，環(huán)氧值為6.6%，阿拉丁試劑有限公司；DMSO、SnCl4(純度99.0%)、乙酸乙酯(純度大于99.5%)，國藥集團化學試劑有限公司；芘(純度大于99.9%)，Sigmar公司；PTX、EVO(純度大于99.9%)，阿拉丁試劑有限公司。普通溶劑如鹽酸、氫氧化鈉、乙醇等，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 H-ESO-HEC兩親性聚合物的制備

稱取1 g HEC緩慢加入至50 mL DMSO中，室溫下磁力攪拌2 h得到均一透明的HEC/DMSO溶液。將適量溶于DMSO中的ESO和催化劑無水SnCl4溶液依次加入至HEC/DMSO溶液中，攪拌反應30 min，得到ESO-HEC兩親性聚合物。稱取2 g ESO-HEC兩親性聚合物于50 mL 0.6 mol/L的NaOH溶液中，在100 ℃恒溫油浴鍋中攪拌反應12 h。反應結束后，將產(chǎn)物進行減壓旋蒸。蒸餾后的固體經(jīng)乙酸乙酯浸泡洗滌，除去甘油和未完全水解的油脂。將浸泡后的固體溶于水中，用鹽酸調節(jié)pH至5～6。溶液經(jīng)乙酸乙酯萃取后，將乙酸乙酯相用熱水洗滌多次，再進行減壓旋蒸，將液體經(jīng)冷凍干燥得到純化的H-ESO-HEC兩親性聚合物。

1.3 H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束的制備

準確稱取100 mg H-ESO-HEC兩親性聚合物于10 mL超純水中，在超聲清洗機中超聲分散30 min。超聲條件：功率75 W，超聲2 s停1 s，經(jīng)0.22 μm 濾頭過濾后得到H-ESO-HEC兩親性聚合物的納米膠束水溶液。

1.4 H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束對PTX/EVO的包載

取5 mL質量濃度為2 mg/mL的H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束溶液置于10 mL玻璃試管中，攪拌狀態(tài)下逐滴加入1 mL 0.1 mg/mL的PTX/乙醇溶液，室溫下超聲30 min，使PTX進入納米膠束核內(nèi)。超聲結束后將該溶液置于截留分子質量3 000的透析袋內(nèi)透析48 h，每隔6 h換一次水，以徹底除去乙醇溶液。將所得溶液統(tǒng)一定容至25 mL，過0.8 μm的微孔濾膜除去未包覆的PTX沉淀物。H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束對EVO的包載同PTX。

1.5 測定與表征

1.5.1 傅里葉紅外光譜(FT-IR)表征

精確稱取2 mg樣品與200 mg的KBr混合均勻，研磨壓片后在Perkin Elmer公司的Frontier-Ⅱ型紅外光譜儀上進行掃描，以純KBr壓片作為背景掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1。

1.5.2 氫核磁共振光譜(1H-NMR)表征

1H-NMR核磁譜圖采用AVANCE Bruker Ⅲ 400型核磁共振儀進行測定，樣品質量濃度為20 mg/mL，溶劑為D2O-d6，測試內(nèi)標為三甲基硅烷(TMS)。

1.5.3 熱重分析(TGA)

利用TA公司的Q500型熱重分析儀對樣品的熱穩(wěn)定性進行表征，樣品質量為5～10 mg，測試的溫度范圍為室溫至600 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮氣保護，體積流量為30 mL/min。

1.5.4 臨界膠束濃度(CMC)表征

H-ESO-HEC兩親性聚合物的CMC值采用芘熒光探針法進行測定：透析方法配制10 mg/mL的H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束水溶液，逐級稀釋，制得質量濃度分別為1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.000 1 mg/mL的納米膠束水溶液，準確移取50 μL的芘/丙酮溶液(濃度6×10-5mol/L)，攪拌下加入至5 mL不同濃度的膠束水溶液中，經(jīng)漩渦振蕩混合器混合均勻，置于超聲波清洗機內(nèi)超聲2 h，然后將該溶液置于37 ℃水浴搖床中振蕩過夜，待結束后冷卻至室溫進行測定。

樣品的熒光光譜在LS-55型熒光光譜儀上進行測量。測試條件：激發(fā)波長339 nm，掃描范圍360～550 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度分別為10和5 nm。

1.5.5 粒徑的測定

H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束的粒徑采用英國Marvern公司的Nano ZS90型納米粒度儀進行測量。測量粒徑時，膠束的質量濃度為0.1 mg/mL，測試前需將樣品置于超聲波清洗機內(nèi)超聲分散30 min，用0.22 μm的濾頭過濾除去膠束聚集體。每個樣品重復測量5次，取平均值，得到平均粒徑。

1.5.6 透射電鏡(TEM)表征

H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束的形貌采用日本電子JEM-2100型透射電子顯微鏡進行表征。取一滴H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束水溶液(質量濃度0.1 mg/mL)置于200目鍍碳膜銅網(wǎng)上，用質量分數(shù)為2%的磷鎢酸溶液染色3 min，50 ℃真空干燥10 min。測試條件：加速電壓200 kV。

1.5.7 H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束對PTX/EVO包封率的測定

配制質量濃度范圍為1.0～4.0 μg/mL的PTX/乙醇溶液，利用紫外可見光分光光度儀測量不同質量濃度PTX溶液在227 nm處的吸光度。吸光度(A)和PTX/乙醇溶液濃度(C)的關系：A=0.156 5C+0.077 1，其中線性相關系數(shù)R2=0.982 2。

EVO/乙醇溶液的標準曲線制備方法同PTX，其中EVO的最大吸收波長為224 nm，吸光度和EVO/乙醇溶液濃度(C)的關系：A=0.159C+0.052 7，其中線性相關系數(shù)R2=0.997 6。

以H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束水溶液做空白對照實驗，利用紫外-可見光分光光度計測定包載PTX膠束在227或224 nm處的吸光度，每個樣品需測試5次。PTX在H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束的包封率采用公式(1)計算。H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束對EVO的包載同PTX。

(1)

2 結果與討論

2.1 H-ESO-HEC的合成

大豆油是世界上產(chǎn)量最豐富的可再生植物油之一，其結構中的雙鍵可以發(fā)生加成、氧化和聚合等反應。其中，ESO是對大豆油結構中的雙鍵進行環(huán)氧化反應得到的一種高附加值的商業(yè)化產(chǎn)物，被廣泛應用于聚氯乙烯塑料、涂料、新型高分子材料和橡膠等工業(yè)領域[18-19]。本實驗HEC為親水主鏈，ESO為疏水單體，DMSO為反應溶劑，在催化劑無水SnCl4的作用下，合成ESO-HEC兩親性聚合物，經(jīng)氫氧化鈉水解后制得一系列羥乙基纖維素接枝環(huán)氧大豆油兩親性聚合物(H-ESO-HEC)。其結構和合成路線如圖1所示。通過改變疏水單體用量和HEC的分子質量，對H-ESO-HEC兩親性聚合物中的親水/疏水基團比例、疏水鏈段鏈長、溶解性能進行調控，為后續(xù)研究聚合物結構與自組裝組行為之間的關系提供實驗基礎。

圖1 H-ESO-HEC兩親性聚合物的合成路線

2.2 H-ESO-HEC的FT-IR分析

圖2為HEC、H-ESO-HEC兩親性聚合物的FT-IR譜圖。在3 400、2 902、1 644、1 368、1 144和1 059 cm-1處的吸收峰均為HEC的吸收峰，依次對應于HEC羥基的伸縮振動峰、亞甲基和次甲基中C—H的伸縮振動峰、吸收水的彎曲振動峰、甲基、亞甲基中C—H的彎曲振動峰和HEC糖苷鍵C—O—C中C—O醚鍵的伸縮振動峰[20]。與HEC的FT-IR譜圖相比，疏水改性得到的H-ESO-HEC聚合物FT-IR譜圖在2 931和1 748 cm-1處出現(xiàn)了2個新的吸收峰。在2 931 cm-1處的吸收峰為脂肪酸鏈上C—H的伸縮振動峰，1 748 cm-1處為酯羰基的伸縮振動峰。結果表明，ESO已成功地接枝到HEC的分子鏈上。

圖2 HEC與H-ESO-HEC的FT-IR光譜圖

2.3 H-ESO-HEC的1H-NMR分析

圖3為HEC和H-ESO-HEC兩親性聚合物的1H-NMR光譜圖。從圖中可以看出，HEC糖環(huán)上各個氫原子信號峰的化學位移在3.31～4.49，其中，HEC基本糖單元上H1、H2、H3、H4、H5和H6各個氫原子的信號峰分別位于4.49、3.61、3.69、3.31、3.88和3.57處。與HEC譜圖相比，H-ESO-HEC譜圖化學位移0.92、1.32～1.58、3.19和2.88附近出現(xiàn)新的吸收峰，其中0.92(a)處的吸收峰為—(CH2)n—CH3中—CH3的氫原子信號峰，1.32～1.58(b)處的吸收峰為—CH2—氫原子信號峰；3.19(c)處的吸收峰為CH—OH中次甲基氫原子的信號峰，2.88(d)處為CH2—COOH中亞甲基的氫原子的信號峰。結果表明，ESO已成功接枝到HEC大分子鏈上。

圖3 HEC與H-ESO-HEC的1H-NMR光譜圖

2.4 H-ESO-HEC的熱穩(wěn)定性能分析

圖4為HEC和H-ESO-HEC兩親性聚合物的TGA和DTGA圖。從TGA圖中可以看出，HEC的初始降解溫度為165.9 ℃，H-ESO-HEC-Ⅴ和H-ESO-HEC-Ⅹ的初始降解溫度分別為186.5和168.4 ℃。H-ESO-HEC兩親性聚合物有2個熱降解過程，分別約在240和450 ℃。從DTGA圖中可以看出，HEC的最大熱降解溫度為230.8 ℃，H-ESO-HEC-Ⅴ和H-ESO-HEC-Ⅹ最大熱降解溫度分別為236.5和247.6 ℃。與HEC相比，H-ESO-HEC-Ⅴ和H-ESO-HEC-Ⅹ兩親性聚合物的熱穩(wěn)定性能有所提高，在質量損失率為65%時，HEC的熱降解溫度為237.4 ℃，而H-ESO-HEC-Ⅴ和H-ESO-HEC-Ⅹ的熱降解溫度均為447.5 ℃。結果表明，HEC經(jīng)ESO疏水化改性后熱穩(wěn)定性能有所提高。

(a) TGA

(b) DTGA

圖4 HEC與H-ESO-HEC的TGA和DTGA圖

Fig.4 TGA and DTGA curves of HEC and H-ESO-HEC copolymers

2.5 H-ESO-HEC納米膠束的CMC值分析

H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束的CMC值采用芘熒光探針技術來測定，以339 nm為激發(fā)波長，在360～550 nm掃描樣品溶液的熒光激發(fā)光譜，繪制熒光光譜中的第1發(fā)射峰與第3發(fā)射峰的強度比隨共聚物質量濃度變化的曲線，轉折點即為共聚物的CMC值。圖5為H-ESO-HEC 兩親性聚合物CMC值的測量曲線。由圖可得，H-ESO-HEC-Ⅴ聚合物的CMC值為336 μg/mL，H-ESO-HEC-Ⅹ聚合物的CMC值為292 μg/mL。說明隨著聚合物中ESO單體用量的增加，H-ESO-HEC聚合物的疏水能力增強，聚合物形成的納米膠束溶液更加穩(wěn)定，CMC值降低。

圖5 發(fā)射峰強度比隨H-ESO-HEC聚合物質量濃度的變化曲線

Fig.5 Plots of the intensity ratio of pyrene emission spectra in water as a function of the log concentration of H-ESO-HEC copolymers

2.6 H-ESO-HEC納米膠束的DLS和TEM分析

圖6為H-ESO-HEC兩親性聚合物自組裝納米膠束的DLS分布圖和TEM圖。從TEM圖中可以看出，H-ESO-HEC聚合物在水溶液中自組裝形成納米級球形膠束，膠束大小相近，邊緣光滑，分布均勻，粒徑約為40 nm。從表1中可以看出，隨著ESO單體用量由1∶1增加至1∶5，聚合物膠束的粒徑變小，說明隨著疏水單體用量增加，H-ESO-HEC聚合物的疏水能力增強，有利于聚合物形成更緊密的膠束，粒徑較小。在相同疏水單體用量的條件下，H-ESO-HEC-Ⅹ聚合物的粒徑為97 nm，H-ESO-HEC-Ⅴ聚合物的粒徑為102 nm。說明聚合物中親水鏈段HEC的分子質量比較高時，得到的膠束粒徑較低。此外，DLS測得聚合物的納米膠束粒徑在97～221 nm，明顯高于TEM測得的膠束粒徑。這可能是由于TEM測定的是膠束在干燥狀態(tài)下的粒徑，而DLS測定的是膠束水系粒徑，在水系狀態(tài)下膠束易潤脹，導致粒徑增大。

(a) DLS

(b) TEM

圖6 H-ESO-HEC-V聚合物自組裝納米膠束的DLS和TEM圖

Fig.6 The size histogram of H-ESO-HEC-V nano- micelles determined by DLS and TEM

2.7 H-ESO-HEC納米膠束包載PTX/EVO

由表1可以看出，H-ESO-HEC兩親性聚合物納米膠束在包載藥物前平均粒徑為97～221 nm，包載PTX后平均粒徑為152～302 nm，包載EVO后平均粒徑為142～286 nm，說明包載藥物后聚合物膠束的粒徑會增加。對于以相對分子質量為50 000的HEC作為起始物得到的H-ESO-HEC，隨著ESO單體用量由1∶1增加至1∶5，其自組裝納米膠束對PTX的包封率由27.9%增大至61.7%，對EVO的包封率由25.2%增大56.7%。說明隨著單體用量增加，聚合物的疏水能力增強，對疏水藥物的包載效果更好，且H-ESO-HEC 聚合物對PTX的包載效果要比EVO好。H-ESO-HEC-Ⅴ聚合物對PTX和EVO的包封率分別為69.1%和62.9%，H-ESO-HEC-Ⅹ 聚合物對PTX和EVO的包封率分別為61.7%和56.7%。說明在ESO單體用量相同的條件下，高分子質量HEC合成的H-ESO-HEC 聚合物膠束對疏水藥物的包載能力更強。

表1 H-ESO-HEC納米膠束對抗癌藥物的包封率

3 結 論

以HEC和ESO為原料，在無水SnCl4的催化作用下于DMSO介質中反應得到ESO-HEC，經(jīng)氫氧化鈉水解后得到一系列H-ESO-HEC兩親性聚合物。在水溶液中利用超聲輔助溶解法制得H-ESO-HEC兩親性聚合物自組裝納米膠束。通過芘熒光探針法測定H-ESO-HEC聚合物的CMC值，CMC值隨共聚物中疏水單體ESO用量的增加而減小。FT-IR和1H-NMR結果表明ESO已成功地接枝到HEC分子鏈中。TGA結果表明經(jīng)疏水改性后HEC的熱穩(wěn)定性能有所提高。TEM和DLS結果表明，H-ESO-HEC聚合物自組裝納米膠束的粒徑范圍為97～221 nm，為均一的球形顆粒。粒徑大小隨疏水鏈段含量和鏈長的增加而降低。一系列的H-ESO-HEC聚合物自組裝納米膠束對PTX、EVO的包封率范圍分別為27.9%～69.1%和25.2%～62.9%，在包載PTX、EVO后的膠束粒徑范圍分別為152～302 nm和142～286 nm，表明H-ESO-HEC聚合物納米膠束在包載疏水藥物后膠束內(nèi)核增大，導致膠束粒徑均增大。