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    銀杏內(nèi)生菌對蘋果鏈格孢霉的抑制作用

    2018-12-05 06:18:42超,璐,靜,琦,
    關(guān)鍵詞:孢霉鏈格細(xì)胞膜

    徐 志 超, 王 璐, 李 靜, 孫 銘 琦, 葉 淑 紅

    ( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

    0 引 言

    鏈格孢霉菌能侵染蘋果葉片引起葉片黑斑病和落葉病,同時在蘋果植株中定殖,在花期侵染花朵從而導(dǎo)致后期果實患霉心病[1]。患有霉心病的蘋果在貯藏過程中易出現(xiàn)霉變腐爛現(xiàn)象,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[2]。目前常用的蘋果霉心病的防治措施主要包括物理套袋和使用化學(xué)制劑,但物理套袋方法處理不當(dāng)會導(dǎo)致雨季果實腐爛,而化學(xué)藥劑防治存在農(nóng)殘的弊端,故生物防治無毒害等優(yōu)勢越來越引起人們的關(guān)注。

    內(nèi)生菌是從植物組織中分離出的內(nèi)生細(xì)菌或真菌,能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分[3]。研究表明,多數(shù)植物內(nèi)生菌具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等生理功能[4-5],考慮篩選具有抑菌效果的植物內(nèi)生菌作為生防菌株,應(yīng)用于蘋果霉心病的防治。銀杏是一種藥食同源的植物,其提取物中的化學(xué)成分有200多種,主要包括黃酮類、萜內(nèi)酯類、有機酸類等生物活性成分[6]。王祖華等[9]篩選的銀杏內(nèi)生細(xì)菌拮抗菌株次級代謝產(chǎn)物對灰霉菌具有明顯的抑制作用。對銀杏內(nèi)生真菌的拮抗作用已有研究,但對內(nèi)生細(xì)菌的研究還不夠深入。課題組前期從不同區(qū)域銀杏分離得到銀杏內(nèi)生細(xì)菌,實驗結(jié)果表明其具有廣譜的抑菌能力[8]。本實驗旨在研究銀杏內(nèi)生菌對蘋果鏈格孢霉的抑制作用機理。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    銀杏內(nèi)生細(xì)菌、蘋果鏈格孢霉菌,實驗室前期分離保存;肉湯培養(yǎng)基,PDA、PD培養(yǎng)基;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)/丙二醛(MOA)試劑盒,南京建成生物工程研究所有限公司。

    PHS-3C pH計,TGL-16M高速冷凍離心機,DDS-307A電導(dǎo)率儀,Thermo酶標(biāo)儀。

    1.2 方 法

    1.2.1 目標(biāo)菌株的篩選

    選取實驗室保藏的10株銀杏內(nèi)生菌,活化制備菌液(106~108CFU/mL),接種于肉湯培養(yǎng)液體發(fā)酵,取發(fā)酵上清液涂布于PDA平板;接種培養(yǎng)5 d的蘋果鏈格孢霉菌菌餅(直徑6 mm)于30 ℃培養(yǎng)3 d,用十字交叉法測定鏈格孢霉菌落直徑[9]。

    1.2.2 目標(biāo)菌株的形態(tài)及生理生化鑒定

    分別通過淀粉水解實驗、油脂水解實驗、石蕊牛乳實驗檢測生理生化指標(biāo)[10-11]。

    1.2.3 發(fā)酵液的制備

    目標(biāo)菌株Q7活化培養(yǎng)12 h后,以2%接種量接入肉湯培養(yǎng)基,28 ℃、120 r/min培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液于8 000 r/min低溫離心15 min,取上清液于0.22 μm濾膜過濾,4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 菌株Q7對蘋果鏈格孢霉的抑制作用

    1.2.4.1 對蘋果鏈格孢霉細(xì)胞膜通透性的影響

    稱取5 g菌絲體接入100 mL PD培養(yǎng)液中,處理組為PD培養(yǎng)基中加入2 mL發(fā)酵液,對照組中加等量無菌水,于30 ℃、20 r/min培養(yǎng),測定不同時間的電導(dǎo)率[12]。

    1.2.4.2 對蘋果鏈格孢霉細(xì)胞膜丙二醛含量的影響

    稱取1.5 g菌絲體接入100 mL PD培養(yǎng)基,30 ℃、120 r/min培養(yǎng)3 d,加入菌株Q7發(fā)酵液2 mL,加入等量無菌水作對照,于不同時間測定丙二醛含量[13]。

    1.2.4.3 對蘋果鏈格孢霉細(xì)胞內(nèi)代謝酶的影響

    發(fā)酵液制備同“1.2.4.1”,于不同時間取適量菌體用蒸餾水沖洗后,用濾紙吸干表面水分,準(zhǔn)確稱量濕菌體質(zhì)量,按質(zhì)量比1∶9加入生理鹽水,并加石英砂研磨,4 000 r/min 離心,上清液即為10%組織勻漿,加入等量無菌水作對照。使用試劑盒測定相關(guān)代謝的酶活力。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 目標(biāo)菌株的篩選

    考察10株銀杏內(nèi)生細(xì)菌的抑菌性,如表1所示。選定的內(nèi)生菌對蘋果鏈格孢霉均表現(xiàn)出較高的抑制效果,其中Q7的抑制效果最強,因此將Q7作為目標(biāo)菌株進行生理生化鑒定并研究其對蘋果鏈格孢霉的抑制作用。

    表1 10株內(nèi)生菌對蘋果鏈格孢霉的抑制作用

    2.2 目標(biāo)菌形態(tài)及生理生化鑒定

    鏡檢結(jié)果如圖1所示,Q7革蘭氏染色呈陰性,菌體形態(tài)呈桿狀。平板培養(yǎng)菌落形態(tài)呈規(guī)則圓點,表面光滑,較透明。

    生理生化結(jié)果表明,Q7對淀粉和油脂的水解能力弱,石蕊牛乳顏色變暗,發(fā)酵液呈偏堿性。初步鑒定銀杏內(nèi)生菌Q7屬于芽孢桿菌屬B.subtilis。

    圖1 菌體B. subtilis Q7的鏡檢結(jié)果

    2.3 B. subtilis Q7對蘋果鏈格孢霉的抑制性

    2.3.1B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉細(xì)胞膜通透性的影響

    生物細(xì)胞膜是一種具有選擇性的半透膜,有些抗菌物質(zhì)能夠破壞細(xì)胞膜的通透性,從而干擾細(xì)胞正常的物質(zhì)運輸[12]。

    由圖2可知,處理組電導(dǎo)率遠高于對照組,說明B.subtilisQ7對鏈格孢霉細(xì)胞膜的破壞較嚴(yán)重。處理組前2 h電導(dǎo)率迅速升高,說明鏈格孢霉細(xì)胞膜遭到嚴(yán)重破壞,胞內(nèi)電解質(zhì)外泄,培養(yǎng)液電導(dǎo)率升高[14]。隨后鏈格孢霉出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),修護被破壞的細(xì)胞,表現(xiàn)在4 h后電導(dǎo)率略有降低,隨著時間的延長電導(dǎo)率略有升高至基本趨于穩(wěn)定。

    圖2 B. subtilis Q7對細(xì)胞膜通透性的影響

    2.3.2B.subtilis. Q7對蘋果鏈格孢霉脂質(zhì)過氧化的影響

    丙二醛(MDA)是細(xì)胞遭受逆境傷害時膜脂過氧化程度大小的主要指標(biāo)之一[15]。處理組菌絲體中MDA含量明顯提高。如圖3所示,在9 h達到峰值,比對照組高50%,說明此時處理組菌絲體膜脂過氧化程度最嚴(yán)重,MDA積累量達到最大。9 h后,處理組MDA含量降低,說明蘋果鏈格孢霉對逆境脅迫的抵御作用減弱,細(xì)胞活性降低,在24 h后基本處于穩(wěn)定狀態(tài)。

    圖3 B. subtilis Q7對細(xì)胞膜MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

    2.3.3B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉SOD的影響

    如圖4所示,前3 h處理組SOD酶活力變化與對照組變化趨勢基本相同,3 h后處理組SOD活力顯著提高,這表明鏈格孢霉在逆境脅迫下,機體做出應(yīng)答反應(yīng),通過協(xié)調(diào)酶的活性來保護細(xì)胞不受外界環(huán)境的影響[13]。隨著時間的延長,SOD活力開始減低,在20 h低于正常水平??赡苁怯捎谀婢趁{迫下機體產(chǎn)生氧自由基含量增加,且細(xì)胞膜被破壞,導(dǎo)致酶蛋白外泄,相對SOD活力降低。

    圖4 B. subtilis Q7對SOD酶活力的影響

    2.3.4B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉POD的影響

    如圖5所示,處理組的POD酶活力在前6 h迅速提高,說明在逆境脅迫下,機體產(chǎn)生的過氧化物含量升高,從而導(dǎo)致機體POD分泌水平提高。隨著時間的延長,細(xì)胞膜損傷程度增加,通透性增大,導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白酶的外泄,細(xì)胞內(nèi)POD活力降低,24 h后POD活力趨于穩(wěn)定,但其活性僅為對照組的一半。

    圖5 B. subtilis Q7對POD酶活力的影響

    2.3.5B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉PPO的影響

    如圖6所示,處理組的PPO酶活力迅速降低,在9 h左右,PPO酶活力出現(xiàn)短暫且小幅恢復(fù),但仍遠低于正常酶活水平,說明鏈格孢霉在逆境脅迫下,機體做出應(yīng)答反應(yīng),但其抗逆性較差。12 h后趨于穩(wěn)定,其活力僅為正常酶活的1/3。

    圖6 B. subtilis Q7對PPO酶活力的影響

    B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物對胞內(nèi)代謝酶活的影響可能有兩方面的原因:一是由于B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物對蘋果鏈格孢霉細(xì)胞膜的破壞,加劇膜脂過氧化程度,使細(xì)胞膜的通透性增加,導(dǎo)致胞內(nèi)酶的外泄;另一方面,B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物干擾或抑制酶的合成途徑,從而導(dǎo)致整體酶活的降低。

    3 結(jié) 論

    銀杏內(nèi)生菌芽孢桿菌B.subtilisQ7發(fā)酵液對蘋果鏈格孢霉具有明顯的抑制作用。實驗發(fā)現(xiàn),B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物提高了蘋果鏈格孢霉細(xì)胞膜透性,加劇細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,影響其體內(nèi)代謝酶SOD、POD以及PPO的酶活力。B.subtilisQ7 代謝產(chǎn)物所表現(xiàn)的抑菌性質(zhì)可能與宿主銀杏的活性成分(如黃酮、多糖等)相關(guān),今后將繼續(xù)深入研究B.subtilisQ7發(fā)酵液中對鏈格孢霉起抑制性作用的主要活性物質(zhì)的類別及生理生化特性,完善銀杏內(nèi)生細(xì)菌拮抗作用機制的理論基礎(chǔ)。

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