甲基糠基二硫醚對(duì)沙門氏菌毒力基因表達(dá)的影響

吳 虹 燕， 魏 麗 娜， 李 鑫 鑫， 楊 春 雪， 侯 紅 漫， 張 公 亮

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

引發(fā)人畜共患病的沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的食源性致病菌，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌[1]?；谄渲嗵?LPS)中側(cè)鏈多糖(O-抗原)和鞭毛蛋白(H-抗原)種類的不同，可分為2 579種血清型[2]，絕大多數(shù)血清型能在人和動(dòng)物間交叉感染，引發(fā)人和動(dòng)物敗血癥、胃腸炎和腹瀉等癥狀[3]。流行病學(xué)研究表明，在美國(guó)，每年沙門氏菌感染案例高達(dá)4萬例[2]；在我國(guó)，由感染沙門氏菌引起的細(xì)菌性食物中毒事件也不占少數(shù)[4]。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的縱向發(fā)展和橫向廣泛應(yīng)用，越來越多的研究表明沙門氏菌的致病性是大量毒力因子如毒力島、毒力質(zhì)粒攜帶的spv操縱子、黏附素、鞭毛等相互作用的結(jié)果[5-6]。毒力島1(SPI-1)遺傳性狀穩(wěn)定，幾乎存在于所有沙門氏菌血清型中，負(fù)責(zé)編碼與細(xì)菌致病性有關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)1(T3SS-1)，分泌性效應(yīng)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白[7]。位于SPI-1上的調(diào)節(jié)蛋白HilA能夠激活編碼T3SS-1的所有操縱子，因而在沙門氏菌感染的初始階段起著重要作用[8]。HilA的表達(dá)受SPI-1內(nèi)的HilC和HilD，以及在另一獨(dú)立島內(nèi)的RtsA聯(lián)合作用所控制，這三者都可以與hilA啟動(dòng)子相連以誘導(dǎo)其表達(dá)[9]。

長(zhǎng)期以來，抗生素的濫用所造成的安全問題層出不窮，沙門氏菌耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移和多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給人類和動(dòng)物的健康帶來了極大的威脅[10]。結(jié)合消費(fèi)者對(duì)食品色香味和營(yíng)養(yǎng)性的訴求，天然來源的抑菌劑如植物素、植物提取物、次級(jí)代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究引起了廣泛的關(guān)注[11]。含硫香料作為天然食品添加劑的一種，憑借香味濃郁、閾值低等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)加工中[12]。其中，硫醚類香料不僅因具備特殊的氣味而在豐富食品風(fēng)味方面發(fā)揮著重要的作用，也因某些含氧官能團(tuán)的存在而展現(xiàn)出了一些生理活性功能[13]。Kiesel等[14]探究了二烯丙基三硫醚(diallyl trisulfide，DATS)對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明DATS可以作為一種預(yù)防乳腺癌細(xì)胞的生物活性物，阻止切口通路組分在癌細(xì)胞中的過度表達(dá)。孟君等[15]研究發(fā)現(xiàn)，新鮮的大蒜提取液能夠有效抑制幾種常見食源性致病菌的生長(zhǎng)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)具有抑菌活性的主要成分為二烯丙基二硫醚(diallyl disulfide，DADS)和DATS。本課題組前期的研究結(jié)果也證明了硫醚類香料對(duì)常見食源性致病菌有較好的抑制效果[16]。目前，考察含硫香料對(duì)致病菌毒力基因調(diào)控作用的相關(guān)研究并不多見，有待補(bǔ)充完善。本研究選取常見硫醚類香料中的甲基糠基二硫醚(methyl furfuryl disulfide，MFDS)為原料，在基因水平上，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)探究其對(duì)沙門氏菌毒力基因(hilA、hilC、hilD)表達(dá)情況的影響，為探索沙門氏菌的毒力機(jī)制提供理論支持，同時(shí)為天然來源抑菌劑在食品領(lǐng)域的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

硫醚類香料MFDS選自GB 2760—2014，香料與提取制造協(xié)會(huì)(FEMA)編號(hào)為3362，美國(guó)Sigma公司。沙門氏菌ATCC 14028，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，使用前在含40%甘油的凍存管中于-80 ℃保存。

牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、水解酪蛋白、無水乙醇、瓊脂粉，均為國(guó)產(chǎn)分析純，博諾試劑公司；RNase-free water、DEPC水、實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)，生工生物工程股份有限公司；細(xì)菌總RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄除雜試劑盒，寶生物工程有限公司。

UV-1750型紫外分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；MyiQTM2型熒光定量PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司；Spectra Max M2酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制與菌株活化

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏0.3 g，NaCl 0.5 g，蛋白胨1 g，去離子水定容至100 mL，pH調(diào)至7.0左右。

取凍存菌株活化培養(yǎng)2次，轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中，37 ℃下150 r/min過夜培養(yǎng)，備用。

1.2.2 最低抑菌濃度的測(cè)定

參照Miladi等[17]的方法，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定MFDS對(duì)沙門氏菌作用的最低抑菌濃度(MIC)。用二甲基亞砜(DMSO)將MFDS原液配成初始濃度為8 mmol/L的儲(chǔ)備液，水解酪蛋白肉湯進(jìn)一步將其稀釋為不同濃度的工作液添加至96孔板中，并添加相同濃度的菌液。以MHB作陰性對(duì)照，含菌液稀釋液的MHB為生長(zhǎng)對(duì)照孔，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，每3 h測(cè)定一次OD600。

1.2.3 MFDS作用下沙門氏菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將菌液培養(yǎng)至濃度約108CFU/mL時(shí)，吸取1 mL于99 mL液體培養(yǎng)基中，分別添加40 μL不同濃度的MFDS，以添加等體積的DMSO作為對(duì)照組。37 ℃下150 r/min搖床培養(yǎng)12 h，每隔3 h利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600。以時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制MFDS作用后沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 沙門氏菌總RNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

向沙門氏菌培養(yǎng)液中添加不同亞抑菌濃度的MFDS，以未添加MFDS的作為對(duì)照組，于37 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。吸取1 mL菌液于12 000 r/min下4 ℃離心2 min，獲得菌體。后續(xù)操作按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA的純度及濃度。

1.2.5 qRT-PCR法探究MFDS對(duì)沙門氏菌毒力基因表達(dá)的影響

將提取到的質(zhì)量合格的沙門氏菌總RNA進(jìn)行純化處理，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA并以其為模板，以沙門氏菌主要毒力基因hilA、hilC、hilD為靶基因，16S rRNA為內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR。所用的熒光引物對(duì)由生工生物工程有限公司合成，引物對(duì)序列見表1。

qRT-PCR過程的反應(yīng)參數(shù)：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；63.3 ℃，25 s；72 ℃，15 s。于80 ℃處停留15 s，收集熒光信號(hào)，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，并在60～95 ℃范圍建立熔解曲線。根據(jù)所得到的循環(huán)數(shù)，參照Vikram等[18]的方法計(jì)算和分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行顯著性分析，P<0.01具有極顯著差異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 MFDS對(duì)沙門氏菌的最低抑菌濃度

由表2可以看出，當(dāng)MFDS濃度高于2 mmol/L 時(shí)，沙門氏菌在96孔板內(nèi)的生長(zhǎng)情況均受到抑制；而當(dāng)其終濃度稀釋至1 mmol/L時(shí)，沙門氏菌開始出現(xiàn)生長(zhǎng)，因此MFDS對(duì)沙門氏菌的MIC為2 mmol/L。

表2 MFDS對(duì)沙門氏菌作用的最低抑菌濃度

2.2 MFDS對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)曲線的影響

加入不同濃度的MFDS后，沙門氏菌的生長(zhǎng)情況如圖1所示。在MIC下，沙門氏菌的生長(zhǎng)受到較為明顯地抑制；在1/2 MIC，與對(duì)照組相比，MFDS抑制了約一半的沙門氏菌生長(zhǎng)。MFDS濃度在1/4～1/32 MIC，OD600與對(duì)照組差距很小，表明其對(duì)沙門氏菌的生長(zhǎng)不再有明顯的抑制效果。因此，MFDS對(duì)沙門氏菌的抑制作用具有濃度依賴性，1/4、1/8、1/16和1/32 MIC可作為不影響沙門氏菌生長(zhǎng)的亞抑菌濃度應(yīng)用于后續(xù)研究。

圖1 MFDS對(duì)沙門氏菌的生長(zhǎng)的影響

2.3 沙門氏菌總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)

經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)，提取得到的RNA樣品質(zhì)量濃度分別為355.78、276.55、410.22、285.46、295.66 ng/μL。OD260/OD280分別為1.97、2.01、2.09、1.95、2.01，符合濃度及純度要求。圖2為不同濃度MFDS作用沙門氏菌后RNA提取的電泳結(jié)果，如圖2所示，總RNA提取效果良好，降解程度小，完整度高，可用于下步研究。

2.4 沙門氏菌毒力基因及內(nèi)參基因引物對(duì)的特異性

各亞抑菌濃度的MFDS與沙門氏菌培養(yǎng)12 h 后，提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到熔解曲線，如圖3所示。Tm含義說明：每種基因設(shè)置了3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，當(dāng)各基因3個(gè)平行結(jié)果的峰值落在同一Tm處，說明qRT-PCR過程中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，表明所用引物對(duì)特異性良好。圖3(a)左側(cè)各組為hilA基因，Tm均在80 ℃；右側(cè)各組為內(nèi)參基因16S rRNA，Tm均在86 ℃。圖3(b)左側(cè)各組為hilD基因，Tm均在83.5 ℃；右側(cè)各組為hilC基因，Tm均在84.5 ℃。各組基因的熔解曲線均呈現(xiàn)單一峰，表明所用引物對(duì)的特異性良好，可用于后續(xù)qRT-PCR檢測(cè)。

M，Marker；1，1/4 MIC；2，1/8 MIC；3，1/16 MIC；4，1/32 MIC；5，空白對(duì)照

圖2 不同濃度MFDS作用沙門氏菌后RNA提取的電泳結(jié)果

Fig.2 Electrophoretogram of RNA extraction fromSalmonellaat different MFDS concentrations

(a) 毒力基因hilA和內(nèi)參基因16S rRNA

(b) 毒力基因hilD和毒力基因hilC

圖3 qRT-PCR法引物驗(yàn)證的熔融曲線

Fig.3 The melting curves of qRT-PCR primers

2.5 MFDS對(duì)沙門氏菌毒力基因表達(dá)的影響

如表3所示，沙門氏菌與不同濃度MFDS共培養(yǎng)12 h后，3種毒力基因hilA、hilC、hilD的表達(dá)量呈劑量依賴性下調(diào)。經(jīng)1/32 MIC的MFDS作用后，與對(duì)照組相比，3種基因表達(dá)量的變化無顯著性差異。當(dāng)濃度高于1/16 MIC，與對(duì)照組相比，三者的表達(dá)表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，表達(dá)量分別為對(duì)照組的64.82%、63.34%和68.35%。特別是當(dāng)MFDS濃度增大到1/4 MIC時(shí)，hilA、hilC、hilD的表達(dá)量均下調(diào)了約215%，為對(duì)照組的46.76%。結(jié)果表明，MFDS呈劑量依賴性抑制毒力基因hilA、hilC、hilD的表達(dá)。

表3 不同濃度MFDS對(duì)沙門氏菌毒力基因表達(dá)量的影響

Tab.3 Effects of different concentrations of methyl furfuryl disulfide on the expression of virulence genes inSalmonella

基因c(MFDS)/MIC相對(duì)表達(dá)量/%hilA對(duì)照100.001/3294.33a±2.731/1664.82b±4.201/857.23bc±3.031/450.70c±5.71hilC對(duì)照100.001/3295.37a±4.021/1663.34b±2.241/854.10bc±4.941/447.44c±4.23hilD對(duì)照100.001/3292.89a±2.471/1668.35b±2.211/851.84c±2.261/442.13d±2.77注:字母a、b、c代表數(shù)據(jù)顯著性分析結(jié)果,不同字母表示與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié) 論

在96孔培養(yǎng)體系下測(cè)定MFDS對(duì)沙門氏菌作用的MIC為2 mmol/L。進(jìn)一步考察了不同濃度的MFDS對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)曲線影響的結(jié)果顯示：MFDS在MIC下對(duì)沙門氏菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用；在1/2 MIC，細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線處于較低狀態(tài)；1/4～1/32 MIC，MFDS對(duì)沙門氏菌的生長(zhǎng)不再有明顯地抑制效果。qRT-PCR法研究結(jié)果表明，1/4、1/8、1/16、1/32 MIC亞抑菌濃度下的MFDS以濃度依賴性的方式下調(diào)沙門氏菌毒力基因(hilA、hilC、hilD)的表達(dá)水平。且當(dāng)MFDS的添加濃度高于1/16 MIC時(shí)，與對(duì)照組相比，毒力基因hilA、hilC、hilD的表達(dá)水平均呈極顯著性降低(P<0.01)。