EMS誘變處理蕓豆(Phaseolous vulgaris L.)種子條件分析

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(1.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山西 太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所， 山西 忻州 034000；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所， 山西 太原 030031)

蕓豆(PhaseolusvulgarisLinn.sp.)學(xué)名菜豆，是普通菜豆(如小黑蕓豆、小白蕓豆等)和多花菜豆(如圓奶花蕓豆H、N、D、X等)的總稱[1]。蕓豆在我國(guó)種植面積廣泛[2]，蕓豆籽粒營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白、碳水化合物、膳食纖維及多種人體必需的維生素和礦物質(zhì)[3]，食藥同源，是現(xiàn)代功能食品開(kāi)發(fā)的重要資源[4]。然而，在蕓豆的長(zhǎng)期育種過(guò)程中，篩選和育種目標(biāo)太過(guò)單一，造成了在選育過(guò)程中遺傳基礎(chǔ)狹窄的限制，所以尋找打破狹窄的遺傳基礎(chǔ)的方法，加快蕓豆的種質(zhì)創(chuàng)新成為需要解決的問(wèn)題。化學(xué)誘變具有特異性強(qiáng)，誘變后代較易穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)?；瘜W(xué)誘變是指利用化學(xué)誘變劑處理植物材料，以誘發(fā)可以遺傳的突變，然后根據(jù)育種目標(biāo)，對(duì)這些變異進(jìn)行鑒定、選擇和固定，育成需要的遺傳穩(wěn)定的品系或品種[5]。通過(guò)化學(xué)誘變已得到一些有價(jià)值的材料。Gustafsson等[6]用芥子氣處理大麥獲得突變體，Laudencia-Chingcuanco等[7]從創(chuàng)建的六倍體小麥EMS突變體庫(kù)中得到一個(gè)突變株，對(duì)這一突變株進(jìn)行分離得到Dy 10和AX 1高分子質(zhì)量谷蛋白亞基缺陷突變株。其中甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulfonate,EMS)目前在作物誘變育種中具有很高的應(yīng)用價(jià)值，因其具有成本低、易操作、突變率高、染色體畸變相對(duì)較少、突變多為點(diǎn)突變且顯性突變率高等優(yōu)點(diǎn)[8]，使得EMS在作物化學(xué)誘變育種中應(yīng)用效果明顯，得到了一致公認(rèn)。

EMS分子具有多個(gè)活性烷基，可置換堿基中的氫原子，從而起到對(duì)堿基的烷化作用。EMS烷化作用主要發(fā)生于DNA的鳥(niǎo)嘌呤(G)上，烷基化的鳥(niǎo)嘌呤不再與胞嘧啶配對(duì)，而與胸腺嘧啶配對(duì)，導(dǎo)致G/C突變?yōu)?T，利用EMS誘變構(gòu)建突變體庫(kù)已成為獲得突變體、創(chuàng)新種質(zhì)和育種的有效手段[9]。據(jù)IAEA/FAO突變品種數(shù)據(jù)庫(kù)最新統(tǒng)計(jì)，截止2017年10月，聯(lián)合編入目錄的數(shù)據(jù)庫(kù)中有71個(gè)國(guó)家3 271個(gè)植物突變品種，其中通過(guò)EMS育成的品種有106個(gè)，我國(guó)利用EMS育成品種5個(gè)。各國(guó)學(xué)者對(duì)EMS誘變作物種子的適宜劑量進(jìn)行了廣泛的研究。選擇適宜的劑量(劑量=處理液劑量×處理時(shí)間)是得到理想突變株、獲得最佳突變率、提高突變頻率的關(guān)鍵[10]。不同作物都有一定范圍的適宜劑量，在適宜劑量范圍內(nèi)，能更高效地產(chǎn)生突變體，并保持原有的優(yōu)良性狀[11]。Vicente-Doleara等利用不同濃度誘變西葫蘆，研究表明，致死率達(dá)40%，65 mmol/L的EMS處理液為最佳誘變處理?xiàng)l件[12]。胡志峰等研究發(fā)現(xiàn)，0.7%EMS誘變處理9 h和0.9%EMS誘變處理6 h的組合為金花菜種子最佳誘變條件[13]；王學(xué)征等研究表明，EMS處理濃度1.0%、誘導(dǎo)時(shí)間9 h是西瓜品系“W 1-17”種子最佳誘變條件[14]；孔德培等研究表明，0.6%EMS溶液對(duì)石系亞1號(hào)棉花種子處理8 h，誘變效果最佳[15]。詹遠(yuǎn)華等研究表明，EMS處理豇豆種子，劑量以濃度0.3%EMS、時(shí)間3～4 h為宜。[16]

IAEA/FAO突變品種數(shù)據(jù)庫(kù)可見(jiàn)各國(guó)育成大豆、綠豆等豆類突變品種304個(gè)，俄羅斯育成蕓豆突變品種2個(gè)(Mukhranula，Svetlaya)，但數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)有利用EMS育成的蕓豆品種。利用EMS對(duì)蕓豆進(jìn)行突變篩選和誘變育種的研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以誘變劑EMS誘變處理蕓豆品種“英國(guó)紅”的純系干種子，采用5個(gè)EMS誘變濃度(0.0%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)，5個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間(0，6，8，10，12 h)，分析誘變后的種子發(fā)芽率、相對(duì)出苗率和相對(duì)成苗率，確定EMS對(duì)蕓豆種子的最佳誘變條件，以期為蕓豆EMS誘變育種技術(shù)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試蕓豆種

試驗(yàn)材料為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所雜糧研究室從蕓豆品種“英國(guó)紅”連續(xù)定向選擇出的純系干種子，種子飽滿、圓潤(rùn)、無(wú)破損、色澤與大小均勻一致。

1.1.2 供試試劑

EMS誘變劑(甲基磺酸乙酯)原液購(gòu)于山西基諾泰克生物科技有限公司，由美國(guó)SIGMA公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

參考國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用EMS對(duì)蓖麻[17]、大豆[18]、小豆[19]、芝麻[20]、大麥[21]的誘變劑配置方法及處理?xiàng)l件，選擇本試驗(yàn)中EMS處理的濃度和時(shí)間。試驗(yàn)設(shè)5種濃度梯度×5種時(shí)間水平，共25個(gè)處理，每處理3次重復(fù)。5種濃度梯度：0.0%EMS，0.4%EMS，0.6%EMS，0.8%EMS，1.0%EMS(因素A 1-A 5)。浸種時(shí)間：0，6，8，10，12 h(因素B 1-B 5)。

試驗(yàn)設(shè)不浸種不做EMS處理的蕓豆做對(duì)照。

1.2.1 不同濃度EMS溶液的配置

EMS溶液濃度配置見(jiàn)表1。

表1 EMS溶液濃度配置

溶液濃度原液95%酒精0.01mol/L磷酸緩沖液(pH=7.2)0.0(ck)005000.4284900.6374900.8464901.055490

1.2.2 種子處理

將蕓豆種子預(yù)先劃破種皮，用蒸餾水浸泡10 min，然后將浸泡過(guò)的種子擦干，100粒為一個(gè)處理，共60個(gè)處理；各處理在通風(fēng)櫥中浸入500 mL不同濃度EMS溶液中，然后在28 ℃搖床上分別震蕩6，8，10，12 h。浸種結(jié)束后，在通風(fēng)櫥中每個(gè)處理加入5%的1 mol/L硫代硫酸鈉(Na2S2O3)1 000 mL，混勻后，將溶液倒入廢液筒，將各處理種子蒸餾水沖洗10 min后，平鋪在濕潤(rùn)濾紙上，稍干后，種子直接種在砂床發(fā)芽盒中，28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)催芽；廢液筒中廢液用20%的1 mol/L硫代硫酸鈉(Na2S2O3)溶液中和后，丟棄。

1.2.3 催芽方法和發(fā)芽率測(cè)定

EMS誘變處理且種子稍干后，將各處理種子及對(duì)照利用砂盒發(fā)芽，做好標(biāo)記，置于(25±1)℃光照培養(yǎng)箱中。催芽7天后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=(供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.2.4 測(cè)定成苗率的指標(biāo)與方法

發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束1周后將出苗種子移栽于溫室，移栽20 d后統(tǒng)計(jì)成苗率，計(jì)算相對(duì)成苗率。

相對(duì)出苗率(%)=(處理的出苗率/對(duì)照出苗率)×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。采用Excel 2007軟件進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變處理對(duì)蕓豆種子發(fā)芽率的影響

2.1.1 EMS不同濃度對(duì)蕓豆種子發(fā)芽率的影響

如表2和圖1所示，未經(jīng)EMS處理與緩沖液浸種的蕓豆發(fā)芽率為100%，經(jīng)6，8，10，12 h緩沖液浸種未經(jīng)EMS溶液處理的蕓豆發(fā)芽率分別為60%、51%、29%、19%，說(shuō)明磷酸緩沖液浸種時(shí)間長(zhǎng)短與蕓豆發(fā)芽率存在顯著的負(fù)相關(guān)。當(dāng)時(shí)間一定時(shí)，EMS不同濃度處理對(duì)蕓豆的發(fā)芽率有不同程度的影響。

6 h誘導(dǎo)時(shí)間下，0.4%、0.6%、0.8%、1.0%EMS的發(fā)芽率分別為74%、65%、66%、70%，高于6 h浸種未經(jīng)EMS處理的發(fā)芽率為60%，各濃度EMS處理蕓豆發(fā)芽率顯著高于對(duì)照(p<0.05)，說(shuō)明6 h不同EMS濃度均對(duì)蕓豆發(fā)芽率有提升作用，6 h 0.4%EMS提升作用較大。

12 h誘導(dǎo)時(shí)間下，0.4%、0.6%、0.8%、1.0%EMS的發(fā)芽率分別為10%、6%、6%、8%，遠(yuǎn)低于12 h浸種未經(jīng)EMS處理的發(fā)芽率(19%)，各濃度EMS處理的蕓豆種子發(fā)芽率顯著低于對(duì)照(p<0.05))，說(shuō)明12 h誘導(dǎo)時(shí)間條件下不同EMS濃度對(duì)蕓豆發(fā)芽率有顯著的抑制作用。

8 h誘導(dǎo)時(shí)間下，0.6%EMS的發(fā)芽率顯著低于8 h浸種未經(jīng)EMS處理的發(fā)芽率(p<0.05)，1.0%EMS的發(fā)芽率顯著高于對(duì)照(p<0.05)，說(shuō)明8 h誘導(dǎo)條件下，有提升有抑制。

10 h誘導(dǎo)時(shí)間下，0.4%、0.8%EMS的發(fā)芽率分別為33%、34%，顯著高于10 h浸種未經(jīng)EMS處理的發(fā)芽率(p<0.05)；1.0%EMS處理發(fā)芽率顯著低于對(duì)照(p<0.05)，產(chǎn)生抑制作用。所以，在蕓豆低誘導(dǎo)時(shí)間條件下，EMS不同濃度對(duì)發(fā)芽率有顯著的提升作用；在蕓豆高誘導(dǎo)時(shí)間條件下，EMS不同濃度對(duì)發(fā)芽率有顯著的抑制作用；在本試驗(yàn)中8 h和10 h誘導(dǎo)條件下，EMS對(duì)蕓豆發(fā)芽率的影響呈現(xiàn)出不規(guī)則的抑制和提升作用。

表2 不同EMS處理組合對(duì)蕓豆種子發(fā)芽率的影響

濃度(%)處理時(shí)間(h)06810120100a60d51bc29b19a0.4100a74a49c33a10b0.6100a65c39d27b6c0.8100a66c53ab34a6c1.0100a70b54a9c8bc

圖1 不同EMS濃度對(duì)蕓豆種子發(fā)芽率的影響

2.1.2 EMS不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蕓豆種子發(fā)芽率的影響

未經(jīng)EMS處理與緩沖液浸種的蕓豆發(fā)芽率為100%。由表2和圖2可知，0.4%EMS濃度條件下，經(jīng)6，8，10，12 h誘導(dǎo)，100%蕓豆發(fā)芽率逐步下降為74%、49%、33%、10%。0.6%EMS濃度條件下，經(jīng)6，8，10，12 h誘導(dǎo)，100%蕓豆發(fā)芽率分別逐步下降為65%、39%、27%、6%。0.8%EMS濃度條件下，經(jīng)6，8，10，12 h誘導(dǎo)，100%蕓豆發(fā)芽率分別逐步下降為66%、53%、34%、6%。1.0%EMS濃度條件下，經(jīng)6，8，10，12 h誘導(dǎo)，100%蕓豆發(fā)芽率分別逐步下降為70%、54%、9%、8%。說(shuō)明當(dāng)EMS濃度處理一定時(shí)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增大，對(duì)蕓豆發(fā)芽的抑制作用越大，蕓豆的發(fā)芽率均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)。

圖2 EMS不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蕓豆種子發(fā)芽率的影響

2.1.3 EMS濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)發(fā)芽率的影響

清水與緩沖液浸種對(duì)作物種子發(fā)芽率有顯著影響。未經(jīng)EMS處理與緩沖液浸種的蕓豆發(fā)芽率為100%，經(jīng)6，8，10，12 h緩沖液浸種未經(jīng)EMS溶液處理的蕓豆發(fā)芽率分別為60%、51%、29%、19%。這4個(gè)蕓豆發(fā)芽率是磷酸鹽緩沖液浸泡時(shí)間所致，與EMS并無(wú)關(guān)系。如把誘導(dǎo)時(shí)間B 2作為先決條件，EMS濃度A 2作用于蕓豆，使得蕓豆發(fā)芽率由60%變?yōu)?4%，漲幅為23.33%；而如把EMS濃度A 2作為先決條件，誘導(dǎo)時(shí)間B 2使得蕓豆發(fā)芽率由100%變?yōu)?4%，減幅為26%。26%>21.31%，可視為A 2 B 2共同作用于蕓豆，誘導(dǎo)時(shí)間B 2對(duì)蕓豆發(fā)芽率的作用大于A 2。表3為先決條件不同時(shí)，EMS濃度或誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蕓豆發(fā)芽率的影響(如B 2 A 2代表6 h 0.4%EMS，表示先決條件為浸種6 h，芽率影響由0.4%EMS所致；A 2 B 2表示先決條件為0.4%EMS，芽率影響由浸種6 h所致)。

從表3可看出，EMS濃度為先決條件，芽率的漲幅最小為-94%，最大為-26%，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蕓豆種子發(fā)芽率均是抑制作用；誘導(dǎo)時(shí)間為先決條件，芽率的漲幅最小為-70.00%，最大為23.33%，僅B 2 A 2，B 2 A 3，B 2 A 4，B 2 A 5，B 3 A 4，B 3 A 5，B 4 A 2，B 4 A 4等處理對(duì)蕓豆發(fā)芽率有促進(jìn)作用。組合B 2 A 2，B 4 A 2漲幅相對(duì)較大。

表3 不同處理?xiàng)l件下蕓豆發(fā)芽率的漲幅

處理漲幅(%)處理漲幅(%)A2B2-26.00B2A223.33A2B3-35.00B2A310.00A2B4-33.00B2A48.33A2B5-30.00B2A516.67A3B2-51.00B3A2-5.88A3B3-61.00B3A3-25.49A3B4-47.00B3A41.96A3B5-46.00B3A53.92A4B2-67.00B4A221.43A4B3-73.00B4A3-7.14A4B4-66.00B4A417.86A4B5-91.00B4A5-71.43A5B2-90.00B5A2-55.00A5B3-70.00B5A3-70.00A5B4-94.00B5A4-65.00A5B5-92.00B5A5-55.00

表4 EMS不同濃度和處理時(shí)間對(duì)蕓豆種子萌發(fā)的影響

處理濃度處理時(shí)間(h)發(fā)芽率(%)相對(duì)出苗率(%)相對(duì)成苗率(%)A1B10.00100aA2B10.40100aA3B10.60100aA4B10.80100aA5B11.00100aA2B20.4674b96.51b94.40bA5B21.0670c89.83e88.65eA4B20.8666d91.17de90.12dA3B20.6665d93.50cd93.50cdA1B20.0660e100a100aA5B31.0854f72.83g72.65gA4B30.8853fg90.37e90.30eA1B30.0851gh100a100aA2B30.4849h95.5bc95.44beA3B30.6839i97.00b96.41bA4B40.81034j83.83f82.65fA2B40.41033j93.57cd93.50cdA1B40.01029k100a100aA3B40.61027k91.03de90.12deA1B50.01219l100a100aA2B50.41210m90.87de89.88fA5B41.0109m70.00g69.5gA5B51.0128mn80.54gh78.6gA4B50.8126n73.5g76.89gA3B50.6126n72.97g68.98g

2.2 EMS誘變處理對(duì)蕓豆種子出苗的影響

EMS濃度和處理時(shí)間影響蕓豆種子的發(fā)芽率，在0.05水平上差異顯著。相對(duì)出苗率和相對(duì)成苗率則影響不大。結(jié)果表明，不同的EMS濃度，不同時(shí)間的處理以及兩者互作的因素上對(duì)蕓豆的種子萌發(fā)呈顯著影響(p<0.05)。一般認(rèn)為，經(jīng)過(guò)EMS誘變處理后植株存活50%的劑量(即半致死劑量LD50)為誘變敏感性指標(biāo)，為可遺傳變異應(yīng)該吸收的能量闕值，也是最佳誘變劑量[22]。結(jié)果表明，A 5 B 3，A 4 B 3處理為蕓豆種子EMS處理的適宜條件，其中0.8%EMS濃度處理8 h為最佳誘變條件。

3 討 論

EMS誘變處理對(duì)蕓豆籽粒發(fā)芽有顯著的抑制作用。不同濃度的EMS對(duì)蕓豆籽粒發(fā)芽抑制的時(shí)間效應(yīng)明顯，6 h處理組，蕓豆發(fā)芽率為0.6%～0.8%，EMS濃度間差異不顯著，發(fā)芽率為0.4%～0.6%，EMS濃度間差異顯著(p<0.05)。8 h處理組，蕓豆發(fā)芽率為0.4%～0.8%，EMS濃度間差異顯著(p<0.05)，在0.8%～1%EMS濃度間沒(méi)有顯著性差異。不同EMS處理時(shí)間對(duì)蕓豆種子發(fā)芽抑制的濃度效應(yīng)明顯。在0.4%～0.8%EMS處理濃度條件下，蕓豆籽粒發(fā)芽率在6～12 h處理組間呈顯著差異(p<0.05)，在0.8%以上高濃度EMS處理濃度條件下，蕓豆籽粒發(fā)芽率在6～10 h處理組間呈顯著差異(p<0.05)，在10～12 h處理組間沒(méi)有顯著性差異。由于不同的EMS濃度，處理時(shí)間和兩者間的互作效益都在影響著蕓豆種子的萌發(fā)和出苗成苗情況。以EMS濃度作為先決條件，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蕓豆發(fā)芽率均是抑制作用，以處理時(shí)間為先決條件，不同濃度的EMS處理對(duì)蕓豆發(fā)芽有抑制也有促進(jìn)。兩者相比，EMS誘變時(shí)間對(duì)蕓豆發(fā)芽率的抑制效應(yīng)大于誘變濃度。這與胡志峰等[14]的研究結(jié)果不一致，可能是互作效應(yīng)在不同作物間的影響效果不同導(dǎo)致。

EMS處理對(duì)育種材料的選育和創(chuàng)新種質(zhì)資源具有重大意義，而確定其最佳誘變條件成為了關(guān)鍵。不同作物對(duì)EMS的敏感性不一樣，用的濃度低，處理時(shí)間短則變異效應(yīng)不明顯，所用EMS劑量過(guò)高，誘變處理時(shí)間太長(zhǎng)，則容易導(dǎo)致作物致死速率加快，也不利于獲取目標(biāo)材料，因此，確定最佳誘變條件則至關(guān)重要。孔德培等[23]利用0.6%EMS，8 h處理亞洲棉種子構(gòu)建了EMS種子突變庫(kù)。穆國(guó)俊等[24]利用0.5%EMS，4 h處理陸地棉冀棉20，獲得了纖維改良突變體材料。通過(guò)篩選出最適宜的EMS誘變條件對(duì)EMS誘變構(gòu)建蕓豆突變體同樣具有指導(dǎo)意義。目前已經(jīng)在擬南芥[25-26]、水稻[27]、大豆[28]等作物中構(gòu)建了突變庫(kù)。但是在蕓豆中的EMS誘變處理還未見(jiàn)報(bào)道。本研究中采用5個(gè)EMS誘變濃度(0.0%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)，5個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間(0，6，8，10，12 h),分析誘變后的種子發(fā)芽率，最終篩選出對(duì)蕓豆種子適宜的誘變條件是0.8%EMS濃度和8 h處理時(shí)間。

4 結(jié) 論

EMS誘變處理對(duì)蕓豆發(fā)芽率有顯著的抑制效應(yīng)；EMS誘變濃度對(duì)蕓豆發(fā)芽率的抑制效應(yīng)小于誘導(dǎo)時(shí)間；EMS誘變處理對(duì)蕓豆的相對(duì)出苗率和相對(duì)成苗率無(wú)顯著影響；0.8%的EMS誘變濃度和8 h的誘導(dǎo)時(shí)間組合，是蕓豆種子的最佳誘變條件。

現(xiàn)如今，EMS化學(xué)誘變技術(shù)和分子標(biāo)記相結(jié)合用于尋找突變位點(diǎn)和基因定位[29]，通過(guò)該技術(shù)可以進(jìn)一步研究蕓豆領(lǐng)域的化學(xué)誘變，有必要結(jié)合相關(guān)基礎(chǔ)理論知識(shí)從宏觀到微觀從細(xì)胞到分子，從表型到機(jī)理去研究蕓豆，以便通過(guò)EMS誘變蕓豆拓寬蕓豆的種質(zhì)資源，構(gòu)建突變體庫(kù)。