花櫚木組織培養(yǎng)植株再生體系的建立

， ， ，

(1.貴州大學(xué)林學(xué)院， 貴陽 550025； 2.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 貴州 銅仁 554303)

花櫚木(OrmosiahenryiPrain)，又名花梨木，屬蝶形花科紅豆屬常綠喬木，是國家二級重點(diǎn)保護(hù)植物[1]。其木材結(jié)構(gòu)均勻，硬度適中，耐腐朽且花紋別致，色澤紫紅光亮，是高檔家具、工藝雕刻品和特種裝飾品的珍貴高檔用材樹種[2]；花櫚木還是一種優(yōu)良的園林綠化觀賞樹種和珍貴的中草藥[2]。由于花櫚木種質(zhì)資源稀少，自然繁殖力低下[3]且種子采集十分不易，采用組織培養(yǎng)繁育種苗無疑是一種實(shí)用且高效的途徑。目前關(guān)于花櫚木的組織培養(yǎng)已取得一定的成效，高麗等[4-5]以花櫚木幼苗胚軸為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織且產(chǎn)生了不定芽，并開展了花櫚木莖段低溫脅迫培養(yǎng)及耐冷性試驗(yàn)；喬棟等對花櫚木組織培養(yǎng)中外植體的消毒方法進(jìn)行了研究[6]；姚軍等[7]以花櫚木種子為外植體，初步構(gòu)建了花櫚木組培體系。但以花櫚木莖段為外植體的組織培養(yǎng)快繁體系還未建立。為此，本研究以花櫚木萌發(fā)籽苗莖段為外植體，分別開展了基本培養(yǎng)基、叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基篩選、試管內(nèi)外生根比較試驗(yàn)，以期建立完善的花櫚木組織培養(yǎng)體系，為花櫚木種質(zhì)資源保存和實(shí)現(xiàn)工廠化育苗提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料為人工氣候箱內(nèi)設(shè)置溫度25 ℃，濕度60%，光照12 h/d條件下萌發(fā)10 d的健壯籽苗。

1.2 滅菌方法

采用喬棟等[6]的方法進(jìn)行滅菌，將萌發(fā)10 d的籽苗除去根部，流水下沖洗干凈，于洗滌劑溶液中浸泡15 min，用自來水沖洗30 min后轉(zhuǎn)至超凈工作臺上備用，在超凈工作臺上先用70%乙醇浸泡30 s；再用0.1%升汞滅菌8 min；最后用70%乙醇浸泡30 s；期間用無菌水沖洗4～5次，即獲得無菌材料。將莖段剪切為1～1.5 cm(帶1～2個芽)長的外植體，待接種于滅菌好的培養(yǎng)基中。

1.3 基本培養(yǎng)基的篩選

以MS、B 5、WPM為基本培養(yǎng)基，分別添加激素6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L，瓊脂8 g/L，蔗糖30 g/L，pH調(diào)至5.8。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)接種20瓶，每瓶接種1～2個外植體。從第14天開始，每7天觀察記錄1次外植體誘導(dǎo)和生長情況，60 d后統(tǒng)計試驗(yàn)結(jié)果。

表2 不同基本培養(yǎng)基對花櫚木莖段初代培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)基芽誘導(dǎo)率(%)芽數(shù)(個)14d生長狀況28d生長狀況61d生長狀況基部褐化程度MS80.42±3.38bB6.43±0.45bB出現(xiàn)叢生芽點(diǎn)叢生芽生長迅速叢生芽多,芽生長健壯++WPM40.71±5.29cC4.33±0.23cC無明顯變化無明顯變化叢生芽較少++++B597.15±2.48aA11.67±0.29aA無明顯變化大量叢生芽點(diǎn)叢生芽最多,芽較細(xì)弱---

注：“++”表示愈傷組織的褐化程度，“++++”表示褐化極嚴(yán)重，“---”表示基本無褐化；同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，

同列不同大寫字母表示差異顯著(p<0.01)。

1.4 增殖培養(yǎng)基的篩選

以初代培養(yǎng)的芽為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計6-BA(0.5，1.0，2.0)mg/L和NAA(0.5，1.0，2.0)mg/L兩因素三水平的全面試驗(yàn)，分別添加蔗糖30g/L，瓊脂8 g/L，pH調(diào)至5.8。每個處理2次重復(fù)，每次重復(fù)接種20瓶，每瓶1～2個材料，以篩選增殖培養(yǎng)適宜的激素配比。每10天觀察并記錄1次外植體增殖情況，持續(xù)觀察60 d。

1.5 試管內(nèi)、外生根試驗(yàn)

1.5.1 試管內(nèi)生根及移栽

將增殖培養(yǎng)中高于4 cm、基部粗度0.2 cm以上的健壯芽從組培瓶中取出，基部斜剪45°切口，垂直插入生根培養(yǎng)基中。設(shè)計以基本培養(yǎng)基、NAA、IBA和活性炭(AC)四因素三水平的正交試驗(yàn)(表1)，選用正交表為L9(34)，分別添加蔗糖10 g/L，瓊脂8 g/L，pH調(diào)至6.0。每個處理2次重復(fù)，每次重復(fù)接種20瓶，每瓶1個外植體，每10天觀察并記錄外植體根系生長情況，持續(xù)觀察60 d。在瓶內(nèi)生根的植株中選擇根數(shù)≥4條、根長≥5 cm且葉片數(shù)≥5片的健壯瓶苗30株，移至自然光下3～4 d，再打開透氣膜于20～24 ℃常溫下煉苗3 d，隨后取出植株，洗凈附在根系上的培養(yǎng)基，移栽至已高壓滅菌消毒的混合基質(zhì)(泥炭土∶蛭石∶珍珠巖為1∶1∶1)中，于遮蔭率25%的條件下生長，定期澆水以保持基質(zhì)濕度，觀察記錄移栽苗生長情況，45 d后統(tǒng)計成活率。

表1 試管內(nèi)生根培養(yǎng)正交試驗(yàn)因素水平

水平A培養(yǎng)基BNAA(mg/L)CIBA(mg/L)DAC(g/L)11(MS)1(0)1(0)1(0)22(1/2MS)2(1.0)2(1.0)2(0.5)33(1/2WPM)3(2.0)3(2.0)3(1.0)

1.5.2 試管外生根

試管外生根激素配比選用本研究得出的最適試管內(nèi)生根激素條件：NAA 2 mg/L+IBA 1 mg/L。將叢生芽誘導(dǎo)中高于4 cm、基部粗度0.2 cm以上的健壯苗從組培瓶中取出，基部斜剪45°切口，置于生根液(NAA 2 mg/L+IBA 1 mg/L)中浸泡20 min，取出放置10 min后分別垂直插入純蛭石、純石英砂、蛭石∶泥炭土(1∶1)及石英砂∶泥炭土(1∶1)4種經(jīng)高壓滅菌的基質(zhì)中，每基質(zhì)扦插30株試管苗，于大棚內(nèi)室溫控制在22～26 ℃的環(huán)境中生根，保持基質(zhì)濕度，45 d后統(tǒng)計生根率和根系質(zhì)量。

1.6 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度保持(25±2)℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，光周期為12 h/d。

1.7 統(tǒng)計分析方法

采用PASW statistics 18.0軟件和Excel 2016軟件共同對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析與統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對莖段培養(yǎng)的影響

MS、WPM和B 5等3種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，B 5培養(yǎng)基中的叢生芽誘導(dǎo)率和芽數(shù)均最高，分別達(dá)97.15%和11.67個，誘導(dǎo)率分別比MS和WPM高16.73%和56.44%，芽數(shù)分別為MS和WPM的1.81倍和2.7倍。從芽誘導(dǎo)率、芽數(shù)和基部褐化程度評價最為理想的培養(yǎng)基應(yīng)為B 5，但從后期的生長情況看，其叢生芽生長較細(xì)弱，不利于后續(xù)的增殖和生根培養(yǎng)。MS培養(yǎng)基中開始誘導(dǎo)叢生芽時間相對較短、芽苗生長健壯且1個月以后已逐漸具備轉(zhuǎn)瓶生根或繼代培養(yǎng)的條件,為花櫚木初代培養(yǎng)最適宜的基本培養(yǎng)基。方差分析結(jié)果表明，不同基本培養(yǎng)基間叢生芽誘導(dǎo)率和芽數(shù)均存在極顯著差異(p<0.01)。

同列不同大、小寫字母分別表示差異極顯著(p<0.01)和差異顯著(p<0.05)。下同。

2.2 不同激素配比對莖段叢生芽誘導(dǎo)率的影響

試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明：隨著6-BA濃度的增加，平均增殖率逐漸升高，到2 mg/L時，平均增殖率為58.64%，比0.5 mg/L和1 mg/L水平分別高16.42%和40.86%；而隨著NAA濃度的增高，平均增殖率逐漸下降，到2 mg/L時，平均增殖率僅14.19%，比0.5 mg/L和1.0 mg/L水平分別下降50.25%和25.8%。方差分析(表3)表明，培養(yǎng)基中不同濃度的6-BA和NAA對增殖率的影響極顯著(p<0.01)。因此可得，高濃度的6-BA與低濃度的NAA組合對花櫚木叢生芽的增殖效果較理想，即MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L為增殖培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基。

注：A為瓶內(nèi)生根；B為瓶內(nèi)生根60 d根系；C為瓶外生根；D為瓶外生根45 d根系圖1 瓶內(nèi)外生根植株

表5 花櫚木試管苗生根培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

處理A基本培養(yǎng)基BNAA(mg/L)CIBA(mg/L)DAC(mg/L)開始生根時間(d)生根率(%)根數(shù)(條)根長(cm)1MS0000±00.00±0.000.0±0.00.0±0.02MS110.50±00.00±0.000.0±0.00.0±0.03MS22117±457.15±0.004.1±0.10.8±0.241/2MS01143±450.00±10.114.0±0.62.4±0.651/2MS12033±464.29±10.103.3±0.43.2±0.361/2MS200.555±714.28±3.222.5±0.40.2±0.071/2WPM020.523±485.72±20.23.4±0.31.1±0.181/2WPM10119±285.71±0.005.4±0.52.3±0.491/2WPM21018±392.86±10.105.9±0.42.6±0.1

表3 6-BA和NAA不同濃度組合對增殖培養(yǎng)的結(jié)果

試驗(yàn)號6-BA(mg/L)NAA(mg/L)增殖率(%)10.50.533.33±9.4320.5113.33±0.0030.526.67±0.00410.573.33±9.4351140.00±0.0061213.33±0.00720.586.67±14.1482166.67±4.7192222.58±4.56

2.3 不同生根方式對花櫚木試管苗生根效果的影響

2.3.1 試管內(nèi)生根

花櫚木試管苗試管內(nèi)生根的結(jié)果(表5，圖1 A、B)表明，在MS培養(yǎng)基中，試管苗存在少量生根或幾乎不能生根，已生根的少量試管苗還存在葉片掉落現(xiàn)象；1/2 MS中雖都能誘導(dǎo)根系生成，但誘導(dǎo)率相對較低且根系質(zhì)量差；在1/2 WPM培養(yǎng)基中，開始生根時間、平均生根率、根數(shù)、根長均優(yōu)于其他培養(yǎng)基。激素NAA和IBA單獨(dú)使用和搭配使用均能誘導(dǎo)生根，但搭配使用時效果較好，單獨(dú)使用時，NAA生根效果優(yōu)于IBA。從觀察記錄中發(fā)現(xiàn)，花櫚木瓶內(nèi)生根開始時間較晚且生長較慢，在17 d后才開始產(chǎn)生根突，45 d后根系生長才相對較快，60 d后趨于穩(wěn)定，可見，花櫚木瓶內(nèi)生根培養(yǎng)1周期至少需要60 d。

表4 增殖培養(yǎng)試驗(yàn)方差分析結(jié)果

變差來源離差平方和自由度均方F值A(chǔ)2255.8621127.9325.19**B3323.6221661.8137.12**e5821344.77總和6161.4817

注：F0.05(2,13)=3.81，F(xiàn)0.01(2,13)=6.7

對試管苗瓶內(nèi)生根率、根數(shù)進(jìn)行直觀分析，結(jié)果(表6)表明，四因素對生根率影響的主次關(guān)系為：基本培養(yǎng)基>IBA>NAA>AC，對根數(shù)影響的主次關(guān)系為：基本培養(yǎng)基>AC>NAA>IBA，最優(yōu)組合均為A 3 B 3 C 3 D 3，即1/2 WPM+NAA 2.0 mg/L+IBA 2 mg/L+AC 1 g/L。為此，采用最佳理論組合A 3 B 3 C 3 D 3進(jìn)行生根培養(yǎng)驗(yàn)證，設(shè)計2次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)接種20個材料，結(jié)果得出A 3 B 3 C 3 D 3組合生根率為(67.50±10.61)%，平均根數(shù)為(3.8±1.0)個，生根效果不及實(shí)際試驗(yàn)得出的9號好，從試驗(yàn)總體觀察中得到，幼芽在沒有添加活性炭的培養(yǎng)基中的生長勢優(yōu)于有活性炭的培養(yǎng)基，可能是由于活性炭的吸附性，吸附了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)所致。所以生根培養(yǎng)最佳的培養(yǎng)基應(yīng)為9號，即1/2 WPM+NAA 2.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L。方差分析(表7)表明，4因素對根數(shù)都有極顯著影響(p<0.01)，對生根率的影響，除NAA不顯著外(p>0.05)，其余3因素均有顯著影響(p<0.05)。

表6 增殖培養(yǎng)的極差分析

生根指標(biāo)因素水平1均值k1水平2均值k2水平3均值k3極差R絕對值 最優(yōu)方案生根率基本培養(yǎng)基32.74 80.36 147.02 114.28 3水平NAA79.23 80.79 100.10 20.87 3水平IBA59.95 82.60 117.57 57.62 3水平AC88.20 63.99 107.93 19.74 3水平根數(shù)基本培養(yǎng)基2.7 6.5 9.8 7.1 3水平NAA4.9 5.8 8.3 3.4 3水平IBA5.3 6.6 7.2 1.9 3水平AC6.1 3.9 9.0 5.1 3水平

表7 花櫚木試管苗生根培養(yǎng)方差分析結(jié)果

因變量變差來源離差平方和自由度均方F值誘導(dǎo)率基本培養(yǎng)基9885.57 24942.79 52.57**NAA405.24 2202.62 2.16 IBA2527.77 21263.88 13.44**AC1453.26 2726.63 7.73*誤差846.20 994.02總和15118.03 17根數(shù)基本培養(yǎng)基37.80 218.90 137.89**NAA9.29 24.64 33.87**IBA2.93 21.46 10.68**AC19.37 29.69 70.67**誤差1.23 90.14總和70.62 17

注：F0.05(2,9)=4.26，F(xiàn)0.01(2,9)=8.02。

將試管內(nèi)生根健壯苗移栽至(泥炭土∶珍珠巖∶蛭石為1∶1∶1)基質(zhì)生長45 d，結(jié)果表明，大部分植株已長出2～3片新葉，葉片顏色嫩綠，除3株植株前期萎蔫已經(jīng)死亡外，其余植株長勢均較好，成活率高達(dá)90%。

2.3.2 試管外生根

采用單一基質(zhì)和混合基質(zhì)共4種方式進(jìn)行試管外生根45 d試驗(yàn)，結(jié)果(表8，圖1 C、D)表明，與單一基質(zhì)相比，混合基質(zhì)更適宜花櫚木瓶外生根?；旌匣|(zhì)中平均生根率比單一基質(zhì)高25.77%，平均根數(shù)是單一基質(zhì)的2.77倍，其中以石英砂∶泥炭土(1∶1)基質(zhì)生根率和生根數(shù)最為理想，分別達(dá)88.89%和4.7條，是花櫚木試管苗瓶外生根的理想基質(zhì)。從觀察中發(fā)現(xiàn)，試管外生根16 d可見根突發(fā)生且根系生長相對較快，45 d即可長出完好根系且根系質(zhì)量較好，有大量須根產(chǎn)生，相比瓶內(nèi)生根，可節(jié)約生根時間15 d。方差分析結(jié)果表明，不同基質(zhì)對瓶外生根率和根數(shù)均存在極顯著影響(p<0.01)。

表8 不同基質(zhì)對試管外生根的影響

基質(zhì)生根率(%)根數(shù)(條)純蛭石64.44±3.85cB1.6±0.2cC純石英砂53.33±6.67dB1.4±0.1cC蛭石∶泥炭土1∶180.42±7.22bA3.6±0.4bB石英砂∶泥炭土1∶188.89±3.86aA4.7±0.4aA

3 瓶內(nèi)外生根成本模擬與效益比較

由試驗(yàn)得出，花櫚木試管苗生長較緩慢，生產(chǎn)一批花櫚木組培苗從接種、生根到煉苗移栽，以最短時間計算，試管內(nèi)生根需要225 d(誘導(dǎo)60 d，增殖60 d，生根60 d，煉苗移栽45 d)，試管外生根需要165 d(誘導(dǎo)60 d，增殖60 d，生根45 d)，采用試管外生根可節(jié)約60 d。

瓶內(nèi)生根比瓶外生根多出的成本主要為培養(yǎng)基成本、人工成本和用電成本[8]。以提供1萬株增殖無根苗為例，分別做試管內(nèi)外生根，最終以效益產(chǎn)出作比較(表9)。其中試管無根苗按照試驗(yàn)中最佳的增殖方案培養(yǎng)所得，即在MS+6-BA 2.0+NAA 0.5+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L中進(jìn)行2次增殖培養(yǎng)獲得，每培養(yǎng)瓶接種2個材料，中途替換1次培養(yǎng)基，則共需MS培養(yǎng)基55 L，試管內(nèi)生根需1/2 WPM培養(yǎng)基250 L。

按照市場價，花櫚木苗10元/株，試管內(nèi)生根率按92.86%，移栽成活率按90%，試管外生根率按88.89%計算，人工費(fèi)150元/d、水費(fèi)2元/t、電費(fèi)0.6元/度，營養(yǎng)杯、基質(zhì)和藥品試劑均按市場價計算，以提供1萬株花櫚木試管無根苗，通過試管內(nèi)生根及煉苗移栽最終可獲得8 358株組培苗，試管外生根最終可獲得8 889株組培苗，通過簡易核算，前期成本約1 240.69元，瓶內(nèi)生根成本約12 360.8元，瓶外生根成本約6 540.00元，則生產(chǎn)1株組培苗瓶內(nèi)生根的成本是瓶外生根成本的2.34倍(瓶內(nèi)生根方式約1.36元，瓶內(nèi)生根方式約0.58元)。相比瓶內(nèi)生根，瓶外生根可節(jié)約成本5 820.80元，提高收益18.7%。

表9 花櫚木試管苗瓶內(nèi)外生根成本計算

項(xiàng)目名稱前期成本(元)試管內(nèi)生根及移栽管理成本(元)試管外生根及管理成本(元)藥品試劑費(fèi)263.45 812.30 人工費(fèi)900.00 7050.00 1500.00 電費(fèi)69.24 418.50水費(fèi)8.00 80.00 40.00 營養(yǎng)杯2000.002000.00 基質(zhì)2000.00 3000.00 小計1240.6912360.806540.00

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié) 論

MS為花櫚木初代培養(yǎng)最適宜的基本培養(yǎng)基，初代培養(yǎng)的芽在培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L中進(jìn)行增殖培養(yǎng)效果最好，增殖率達(dá)86.67%；瓶內(nèi)生根最佳的培養(yǎng)基為1/2 WPM+NAA 2.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L+瓊脂8 g/L+蔗糖10 g/L，生根率達(dá)92.86%，平均根數(shù)達(dá)5.7根，將瓶內(nèi)生根苗移栽至泥炭土∶蛭石∶珍珠巖(1∶1∶1)混合基質(zhì)中，成活率達(dá)90%；瓶外生根采用NAA 2 mg/L+IBA 1 mg/L生根液浸泡試管無根苗基部20 min，在基質(zhì)石英砂∶泥炭土(1∶1)進(jìn)行試管外生根效果最好，生根率達(dá)88.89%；模擬計算結(jié)果得出，與試管內(nèi)生根相比，瓶外生根可節(jié)約成本5 820.80元/10 000株，提高收益18.7%。

4.2 討 論

選擇適宜的基本培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵[9]，通常高鹽濃度的培養(yǎng)基利于啟動和增殖培養(yǎng)，低鹽濃度的培養(yǎng)基利于生根培養(yǎng)[10]。試驗(yàn)得出，花櫚木組織培養(yǎng)所適宜的基本培養(yǎng)基與大多數(shù)植物類似，初代適宜為MS，生根培養(yǎng)階段適宜為1/2 WPM。在初代培養(yǎng)誘導(dǎo)階段，雖然MS為最佳的基本培養(yǎng)基選擇，但存在一定的褐化現(xiàn)象，這可能與培養(yǎng)基中含有較高的無機(jī)鹽濃度有關(guān)，通過降低培養(yǎng)基的pH值、縮短轉(zhuǎn)瓶周期或在培養(yǎng)基中加入防褐化劑如PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、Vc(抗壞血酸)、CA(檸檬酸)和AgNO3(硝酸銀)等可有效防止褐化現(xiàn)象發(fā)生[11-12]。

培養(yǎng)基的種類對花櫚木試管無根苗生根效果影響顯著，這與鄒英寧等和王軍娥[13-14]的研究結(jié)果類似?；澳驹嚬軣o根苗在1/2 WPM+IBA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L的生根效果最佳，生根率達(dá)92.86%，研究結(jié)果表明，NAA與IBA單獨(dú)或搭配使用都能誘導(dǎo)花櫚木試管無根苗產(chǎn)生根系，但以搭配使用效果最好，這與何碧珠等[15]的研究結(jié)果一致。

試管苗瓶外生根把生根與馴化有機(jī)地結(jié)合起來，有效縮短了育苗周期，節(jié)約生產(chǎn)成本，相對于瓶內(nèi)生根的組培苗來說，提高了移栽成活率,加速了種苗繁殖的進(jìn)程，是一項(xiàng)在組培工廠化育苗中值得應(yīng)用與推廣的技術(shù)[16]，大量試驗(yàn)證明，瓶外生根的生根率比瓶內(nèi)生根率略低[17]，本試驗(yàn)得出，花櫚木瓶外生根率比瓶內(nèi)生根率低3.97%，瓶內(nèi)生根的苗要適應(yīng)外界環(huán)境，需進(jìn)行煉苗移栽馴化，花櫚木煉苗移栽后存在10%的死亡率，因此，通過對瓶內(nèi)外生根成本的模擬核算得知，瓶外生根可節(jié)約時間成本、經(jīng)濟(jì)成本和提高經(jīng)濟(jì)效益，應(yīng)為花櫚木組織培養(yǎng)最適宜的生根方式。