檸檬苦素對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的治療作用及機(jī)制

王亞軍，陸 穎，周艷芬，王 宇，郭素菡，張 琪，孫 陽

(南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)通常指潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)，主要表現(xiàn)為腸道的慢性非特異性炎癥[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究尚未弄清其病因。目前，在我國UC的發(fā)病率呈不斷升高趨勢[2]。由于此病反復(fù)發(fā)作，患者通常一生難以擺脫藥物。針對UC的治療，以5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑為主，但由于其副作用或因藥物價格昂貴，給患者造成極大的心理、生理以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，這些藥物的臨床應(yīng)用受限[3]。因此，尋找安全高效的治療藥物具有重要意義。

中藥或天然產(chǎn)物因安全、副作用小，一直是當(dāng)前UC研究的熱點。中藥陳皮、枳殼、吳茱萸及白鮮皮等對炎癥性腸病有較好的治療作用，其提取物主要成分之一檸檬苦素具有良好的抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗氧化及抗病毒等作用[4]。檸檬苦素是一種存在于蕓香科(Rutaceae)和楝科(Meliaceae)植物中的三萜類(triterpenoids)化合物，是重要的具有高生物活性的次生代謝產(chǎn)物[5]。Matsuda等[6]報道了從吳茱萸(蕓香料)中分離出的檸檬苦素具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用。Tanaka等[7]報道柑橘中檸檬苦素、奧巴叩酮對氧化偶氮甲烷(AOM)誘導(dǎo)雄性鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生的抑制作用。Berhow等[8]等和Pati等[9]的試驗證明,柑橘類檸檬苦素對人體不存在毒副作用。劉明浩等[10]實驗表明，檸檬苦素對于三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)誘導(dǎo)的炎癥性腸病大鼠有明顯的治療作用。

葡聚糖硫酸鈉(DSS)是一種高分子的硫酸多聚糖，DSS通過抑制DNA合成，破壞腸黏膜屏障，使腸道菌群失調(diào)，腸道抗原進(jìn)入黏膜層，導(dǎo)致繼發(fā)性炎癥反應(yīng)[11]。本實驗建立30 g/L DSS誘導(dǎo)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型[12]，通過給予檸檬苦素灌胃治療，并以目前市面上銷售的治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物5-氨基水楊酸做對照，觀察結(jié)腸炎小鼠的一般情況、結(jié)腸長度和病理損傷程度，研究結(jié)腸組織細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核中NF-κB的表達(dá)變化，探討檸檬苦素對于小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

檸檬苦素(批號:K120301)，西安開來生物工程有限公司；葡聚糖硫酸鈉 (DSS，分子量為(3.6～5.0)×104，批號:160110)，MP Biomedicals公司; 5-氨基水楊酸(5-ASA，批號:A129982)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，批號：20120928)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；兔抗小鼠NF-κB p65、β-actin、Histone一抗 、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，美國 Santa Cruz公司；核蛋白和漿蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液，碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)

C57BL/6小鼠(18～22 g、7～8 周齡、雌性)，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，合格證號為SCXK(蘇)2017-0001。

全價營養(yǎng)顆粒飼料，江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司。

飼養(yǎng)條件，室溫(20±2)℃，濕度55%～65%，明暗交替，光照適度，通風(fēng)潔凈良好。

1.3 DSS誘導(dǎo)的小鼠UC造模方法

C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，給予3% DSS連續(xù)飲用7 d后，繼續(xù)飲用正常水3 d，建立小鼠急性UC模型。

1.4 小鼠分組及實驗方法

C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、檸檬苦素組(limonin)和5-氨基水楊酸組(5-ASA)，每組5只。采用上述方法造模，各治療組給予相應(yīng)藥物，檸檬苦素組給藥劑量為50 mg/(kg·d)，5-ASA組給藥劑量為50 mg/(kg·d)，而模型組給予相同劑量的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，每日1次，連續(xù)灌胃10 d直至實驗結(jié)束。正常組小鼠，每天給予正常水喂養(yǎng)。每天記錄各組小鼠體質(zhì)量。

治療結(jié)束后，小鼠麻醉，摘眼球取血。處死所有小鼠，剖開腹腔暴露全結(jié)腸，縱向切開，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗干凈，平鋪于白紙上，觀察各組小鼠結(jié)腸黏膜損傷情況。取部分結(jié)腸，40 g/mL多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察并評估腸黏膜損傷情況，進(jìn)行組織學(xué)評分。另取部分結(jié)腸進(jìn)行蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測蛋白NF-κB p65的相對表達(dá)量。

1.5 檢測及評估指標(biāo)

1.5.1 小鼠體質(zhì)量記錄

觀察小鼠每日的食量、飲水量、體質(zhì)量、精神狀態(tài)及有無死亡等情況，并做好記錄。

1.5.2 結(jié)腸組織學(xué)病理學(xué)分析

采用50倍放大鏡觀察小鼠結(jié)腸黏膜的大體形態(tài)，有無潰瘍、糜爛、出血點和充血等情況。通過組織病理學(xué)檢查，進(jìn)一步觀察腸黏膜有無水腫、充血、糜爛、潰瘍及隱窩膿腫，炎性細(xì)胞浸潤等改變。

1.5.3 Western blotting法檢測蛋白NF-κB p65的表達(dá)

稱取小鼠冷凍腸組織，勻漿機(jī)低溫勻漿，提取組織總蛋白后，BCA法檢測蛋白定量。給予10%SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜、封閉，加NF-κB p65 抗體用化學(xué)發(fā)光法顯影，定影，圖像處理軟件讀取灰度值并計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 檸檬苦素對結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量的影響

正常組小鼠體質(zhì)量增加、飲食、飲水、活動度及大便均正常?？疾鞕幟士嗨貙Y(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知：各造模組小鼠在給予DSS后，體質(zhì)量開始下降；同時模型組小鼠在給予DSS 3 d后大便開始變稀，病情逐漸增加，并且出現(xiàn)不同程度的便血、體質(zhì)量明顯減輕、懶動、厭食及毛發(fā)干枯等表現(xiàn)，說明造模成功[13-14]。與DSS組小鼠體質(zhì)量降低相比，檸檬苦素組小鼠體質(zhì)量開始逐漸回升，說明檸檬苦素可以緩解DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的臨床癥狀，與模型組相比，這些指標(biāo)(進(jìn)食、體質(zhì)量和活動度)都有一定好轉(zhuǎn)。這表明檸檬苦素對于DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎有良好的治療作用。

n=5, #表示P<0.05，##表示P<0.01，與空白組相比；*表示P<0.05，**表示P<0.01，與DSS模型組相比圖1 檸檬苦素對結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of limonin on body weight

UC是一種以腹瀉、腹痛、黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)的非特異性慢性炎癥性疾病。病理組織學(xué)檢測可見結(jié)腸黏膜炎癥性損傷，黏膜充血水腫、糜爛，潰瘍形成，大量炎性細(xì)胞浸潤[15]。DSS通過抑制DNA合成，破壞腸黏膜屏障，使腸道菌群失調(diào)，腸道抗原進(jìn)入黏膜層，導(dǎo)致繼發(fā)性炎癥反應(yīng)。同時，腸道吞噬細(xì)胞清除細(xì)菌產(chǎn)物的功能被削弱，使腸道炎癥持續(xù)存在，引發(fā)嚴(yán)重的腹瀉、便血等 IBD 相關(guān)癥狀[16]。本研究中建立DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型，發(fā)現(xiàn)檸檬苦素可以緩解DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的臨床病癥，說明檸檬苦素具有潛力用于結(jié)腸炎的治療。

2.2 檸檬苦素對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響

取各組小鼠完整結(jié)腸，考察檸檬苦素對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響，結(jié)果如圖2所示。

(b)數(shù)據(jù)分析n=5,#表示P<0.05，##表示P<0.01，與空白組相比；*表示P<0.05，**表示P<0.01，與 DSS模型組相比圖2 檸檬苦素對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響Fig.2 Effects of limonin on colon length in mice

由圖2可知：與空白對照組相比，患有結(jié)腸炎的小鼠的結(jié)腸明顯縮短，而檸檬苦素給藥組小鼠與DSS組小鼠相比，結(jié)腸長度顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)腸長度恢復(fù)至近正常水平。結(jié)腸炎發(fā)生時，伴有結(jié)腸組織水腫，導(dǎo)致結(jié)腸長度縮短。檸檬苦素能增加DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸長度，表明檸檬苦素能夠改善結(jié)腸組織炎性水腫，有效治療DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。

2.3 檸檬苦素對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜損傷的影響

通過小鼠結(jié)腸HE染色病理分析，考察檸檬苦素對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜損傷的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：模型組小鼠與空白對照組相比，小鼠結(jié)腸黏膜層有中度或重度炎細(xì)胞浸潤，局部有輕度或重度壞死，壞死處已有成纖維細(xì)胞增生，黏膜下層出現(xiàn)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤；50 mg/(kg·d) 檸檬苦素組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，上皮結(jié)構(gòu)較完整，幾乎沒有炎癥細(xì)胞浸潤。5-ASA組小鼠結(jié)腸組織的病理損傷也有一定程度的改善，但沒有相同劑量的檸檬苦素效果好。結(jié)果表明：檸檬苦素能夠減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸黏膜損傷，抑制炎癥細(xì)胞浸潤，從而改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥病變。

圖3 檸檬苦素對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎病理損傷的影響Fig.3 Effects of limonin on DSS-induced colon pathological damage in mice

2.4 檸檬苦素對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響

核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)是UC發(fā)病時腸道內(nèi)眾多免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子[17]，是一類能與多種免疫球蛋白輕鏈基因啟動子κB 序列(5′-GGGACTTTCC-3′)特異性結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)總稱，其可以將信息從胞漿傳遞至細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)[18]，通過調(diào)節(jié)多種促炎介質(zhì)基因的表達(dá)[19-20]，在腸道炎癥反應(yīng)中起樞紐作用。雖然 UC 的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，但是NF-κB p65蛋白介導(dǎo)的信號通路在UC發(fā)生、發(fā)展中的作用十分重要，已成為治療UC潛在的作用靶點。

因此，考察檸檬苦素對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)核轉(zhuǎn)位的影響，結(jié)果如圖4～5所示。

n=5,#表示P<0.05，##表示P<0.01，與空白組相比；*表示P<0.05，**表示P<0.01，與DSS模型組相比圖4 檸檬苦素對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸細(xì)胞漿蛋白 NF-κB的影響Fig.4 Effects of limonin on the protein expression of cytoplasmic NF-κB in colon tissues of mice

n=5,#表示P<0.05，##表示P<0.01，與空白組相比；*表示P<0.05，**表示P<0.01，與 DSS模型組相比圖5 檸檬苦素對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸細(xì)胞核蛋白 NF-κB的影響Fig.5 Effects of limonin on the protein expression of nuclear NF-κB in colon tissues of mice

由圖4～5可知：模型組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞胞漿中NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量顯著低于正常組，具有顯著性差異；而檸檬苦素組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞漿中NF-κB p65蛋白水平顯著高于模型組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。5-ASA組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞漿中NF-κB p65蛋白水平也高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

模型組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量顯著高于正常組，具有顯著性差異(P<0.01)。而檸檬苦素組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白水平顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。5-ASA組小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞漿中NF-κB p65蛋白水平也低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

結(jié)果表明，檸檬苦素可以通過抑制NF-κB p65蛋白的核轉(zhuǎn)位，抑制其活化，進(jìn)一步減少相關(guān)促炎細(xì)胞因子的分泌，從而減輕炎癥反應(yīng)。

3 結(jié)論

利用DSS構(gòu)建小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，并選用檸檬苦素作為治療藥物，深入研究了檸檬苦素對DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎的抑制作用及其作用機(jī)制。結(jié)果表明，檸檬苦素作為一種天然化合物，對實驗小鼠的臨床癥狀及結(jié)腸黏膜的損傷有顯著的改善作用。作用機(jī)制結(jié)果顯示，檸檬苦素可能通過抑制細(xì)胞中NF-κB p65蛋白的核轉(zhuǎn)位，抑制其活化，下調(diào)促炎細(xì)胞因子的分泌，從而治療結(jié)腸炎。因此，本研究為檸檬苦素作為治療結(jié)腸炎藥物的開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)。