核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV的構(gòu)建及其免疫活性觀察

趙臣，王婉瑩，趙佳琪，劉爽，王麗，張夢(mèng)凡

(吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林吉林132013)

急性白血病(AL)是一種常見(jiàn)的、致死性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，病死率高，極易復(fù)發(fā)。微小殘留白血病(MRD)是指急性白血病經(jīng)誘導(dǎo)化療完全緩解或干細(xì)胞移植后，患者體內(nèi)仍然殘留有少量白血病細(xì)胞的狀態(tài)，MRD是急性白血病復(fù)發(fā)的根源。核酸疫苗是將外源基因?qū)雱?dòng)物體細(xì)胞內(nèi)，并通過(guò)宿主細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的[1]。研究發(fā)現(xiàn)，核酸疫苗能同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，激發(fā)白血病患者特異性免疫應(yīng)答，清除化療后殘余腫瘤細(xì)胞，是有望克服MRD的方法之一[2]。2015年1月～2017年12月，我們選擇急性白血病相關(guān)抗原基因MLAA34以及負(fù)性共刺激分子B7H4作為構(gòu)建核酸疫苗靶基因，優(yōu)化抗原表位基因，構(gòu)建核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV，并對(duì)其免疫活性進(jìn)行觀察，旨在為白血病的免疫防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 E.coli DH5α菌株、pEGFPN1質(zhì)粒、pEGFPN1-MLAA34質(zhì)粒、pEGFPN1-B7H4IgV質(zhì)粒、單核巨噬細(xì)胞THP-1為本課題組保存；噻唑藍(lán)(MTT)試劑、限制性?xún)?nèi)切酶(EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ)、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自NEB公司；總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、T4 DNA連接酶和膠回收純化等試劑盒及胎牛血清(FBS)、DMEM(低糖)培養(yǎng)基購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；廣譜蛋白Maker購(gòu)自Hyclone公司；ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；BALB/c小鼠(SPF級(jí)，雌性，6～8周齡)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)動(dòng)物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV的構(gòu)建

1.2.1.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)MLAA34基因(GenBank:AY288977.2)和B7H4IgV基因(GenBank: NM_001190366.1)序列分別設(shè)計(jì)MLAA34基因引物P1/P2和B7H4IgV基因引物P3/P4，見(jiàn)表1。其中MLAA34基因長(zhǎng)度為1 014 bp，B7H4IgV基因長(zhǎng)度為849 bp。P2和P3引物末端分別加入重疊序列GGGGGCGGAGGCTCCGGCGGCGGGGGGTCTGGGG-

GCGGGGGAAGC，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 MLAA34和B7H4IgV基因引物序列

注：P1和P4引物下劃線為酶切位點(diǎn)；P2和P3引物下劃線為互補(bǔ)重疊序列。

1.2.1.2 pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 采用重疊延伸(SOE)-PCR法。分別以pEGFPN1-MLAA34質(zhì)粒和pEGFPN1-B7H4IgV質(zhì)粒為模板，以P1/P2和P3/P4引物擴(kuò)增MLAA-34基因和B7H4IgV基因；再以P1和P4為引物，SOE-PCR法擴(kuò)增MLAA34-B7H4IgV融合基因；最后將pEGFPN1質(zhì)粒和融合基因MLAA34-B7H4IgV分別用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌E．coli DH5α。挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，分別用PCR法、酶切法鑒定。

1.2.2 核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV免疫活性觀察

1.2.2.1 動(dòng)物分組與免疫 BALB/c鼠28只，隨機(jī)分為4組各7只。按試劑盒說(shuō)明書(shū)大量制備和純化質(zhì)粒DNA，并用生理鹽水調(diào)整至1.0 mg/L；P、M、B、MB組分別在小鼠兩側(cè)股四頭肌內(nèi)側(cè)肌內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液pEGFPN1、pEGFPN1-MLAA34、pEGFPN1-B7H4IgV、pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV質(zhì)粒，每只100 μg。接種前24 h，用0.25%布比卡因100 μL預(yù)處理。在0、2、4周，各行1次同劑量加強(qiáng)免疫；分別于0、4、8周眼球取血1.5 mL/只(肝素抗凝)，取血后立即處死無(wú)菌摘取脾臟。

1.2.2.2 血清抗體及細(xì)胞因子水平檢測(cè) 取1.2.2.1中的肝素抗凝血約1.0 mL，離心提取血漿；ELISA法檢測(cè)免疫8周血清中抗體IgG1、IgG2a，以及免疫0、4、8周血清細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2.3 THP-1細(xì)胞增殖抑制作用觀察 將脾臟置于不含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基中，剪去脂肪及筋膜組織；于200目不銹鋼網(wǎng)篩上研碎，重懸于含5% FBS的Hank′s液中；以2 000 r/min離心5 min，低滲裂解紅細(xì)胞；用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基清洗3次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL。脾淋巴細(xì)胞懸液倍比稀釋后，取100 μL加入到培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞中，使效靶比分別為50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔；在37 ℃、5% CO2中孵育24 h進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)設(shè)不同濃度效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔及靶細(xì)胞對(duì)照孔。MTT法檢測(cè)THP-1細(xì)胞增殖情況，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，以此表示小鼠脾淋巴細(xì)胞的殺傷活性。細(xì)胞增殖抑制率=1-(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。

2 結(jié)果

2.1 核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV構(gòu)建結(jié)果 MLAA34-B7H4IgV融合基因PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)約為2 000 bp，與理論值(1 922 bp)相符；pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV酶切后電泳檢測(cè)為5 000～7 500 bp，與理論值(6 655 bp)相符。

2.2 各組血清細(xì)胞因子水平比較 與同組免疫0周時(shí)、同時(shí)點(diǎn)P組比較，免疫4、8周時(shí)M、B、MB組血清細(xì)胞因子IL-2、IL-4水平升高而IFN-γ水平降低(P均<0.05或<0.01)。與同時(shí)點(diǎn)M、B組比較，MB組血清細(xì)胞因子IL-2、IL-4水平升高而IFN-γ水平降低(P均<0.05)；M、B組同時(shí)點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 各組血清IL-2、IL-4、IFN-γ水平比較

注：與同時(shí)點(diǎn)P組比較，aP<0.05，bP<0.01；與M組比較，cP<0.05；與B組比較，dP<0.05；與同組免疫第0周比較，eP<0.05。

2.3 各組血清抗體水平比較 見(jiàn)表3。

表3 各組血清IgG1、IgG2a水平比較

注：與P組比較，aP<0.05；與M組比較，cP<0.05；與B組比較，dP<0.05。

2.4 各組THP-1細(xì)胞增殖抑制率比較 見(jiàn)表4。

3 討論

1990年，美國(guó)學(xué)者Wolff等發(fā)現(xiàn)將純化的DNA或RNA表達(dá)質(zhì)粒直接肌內(nèi)注射給小鼠，可使局部肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該基因，并且這種表達(dá)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可達(dá)數(shù)月甚至終生，這一重大發(fā)現(xiàn)被稱(chēng)為疫苗研究史上第3次革命[3，4]。核酸疫苗制作簡(jiǎn)單、應(yīng)用安全、免疫效果好，可刺激機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，可用于MRD的免疫治療[5]。

表4 小鼠脾淋巴細(xì)胞殺傷活性

注：與同效靶比P組比較，aP<0.05，bP<0.01；與M組比較，cP<0.05；與B組比較，dP<0.05。

導(dǎo)入機(jī)體內(nèi)的目的基因是核酸疫苗發(fā)揮免疫保護(hù)作用的關(guān)鍵。本研究選擇急性白血病相關(guān)抗原基因MLAA-34和負(fù)性共刺激分子B7-H4來(lái)構(gòu)建目的基因。MLAA-34基因與急性單核細(xì)胞白血病的發(fā)生密切相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)能抑制白血病細(xì)胞在體外增殖，誘發(fā)白血病細(xì)胞的凋亡，與急性白血病的不良預(yù)后密切相關(guān)[6～8]；B7-H4可以抑制T細(xì)胞的激活、增殖，抑制細(xì)胞因子釋放和T細(xì)胞毒作用，參與了腫瘤的免疫逃逸[9]。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4的IgV樣區(qū)與MHC分子輕鏈可變區(qū)作用相似，B7-H4主要通過(guò)其IgV樣區(qū)與受體相結(jié)合，從而抑制T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的釋放和細(xì)胞毒作用[10]，對(duì)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用[11]，是理想的腫瘤免疫治療的靶基因。

本研究采用SOE-PCR技術(shù)將兩個(gè)目的基因MLAA-34和B7-H4IgV融合在一起，形成MLAA34-B7H4IgV融合基因，兩個(gè)基因之間采用柔性肽基因GGGGGCGGAGGCTCCGGCGGCGGGGGGTCTGGGGGCGGGGGAAGC作為重疊序列，保證了兩個(gè)蛋白融合表達(dá)且正確折疊，MLAA-34和B7-H4IgV皆能發(fā)揮其獨(dú)特功能，相比于限制性?xún)?nèi)切酶的酶切更加簡(jiǎn)便快捷[12]。將此融合基因作為核酸疫苗的目的基因，利用B7-H4IgV將MLAA-34表達(dá)到免疫細(xì)胞表面，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體和細(xì)胞因子，拉近免疫細(xì)胞與靶細(xì)胞的距離；之后anti-B7H4IgV與靶細(xì)胞表面B7-H4受體結(jié)合，阻斷了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，提高T細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，激活T細(xì)胞釋放因子和發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[9]，使核酸疫苗充分發(fā)揮其免疫保護(hù)作用。

本研究表明，免疫BALB/c小鼠后，MB組THP-1細(xì)胞增殖抑制率高于同效靶比其他各組。這表明小鼠脾淋巴細(xì)胞在核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV的作用下，被致敏活化，對(duì)相應(yīng)的白血病細(xì)胞產(chǎn)生了較強(qiáng)的增殖抑制作用；同時(shí)BALB/c小鼠經(jīng)核酸疫苗免疫后，MB組血清IL-2和IFN-γ水平增高。這說(shuō)明在核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV的作用下，其細(xì)胞免疫被激活，產(chǎn)生了較強(qiáng)的特異性細(xì)胞免疫，參與了系統(tǒng)機(jī)體免疫應(yīng)答。此外，BALB/c小鼠經(jīng)核酸疫苗免疫后，MB組血清IgG1水平高于其他各組，而細(xì)胞因子IL-4水平降低。這說(shuō)明該核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV能誘發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫，增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，具有明顯的免疫保護(hù)作用。

總之，本研究以?xún)?yōu)勢(shì)表位基因構(gòu)建了核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV，并對(duì)其抗原性和免疫原性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)核酸疫苗能激活動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞免疫和體液免疫，對(duì)白血病細(xì)胞具有殺傷作用，具有明顯的抗白血病效應(yīng)，為白血病的免疫治療研究奠定了基礎(chǔ)。