miR-19a調(diào)控BMPR2與VEGF在肺動脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)中的作用

林志武，程生稞，付勇，楊齊，鄧明彬

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

miRNA是一種無編碼功能的單鏈RNA，主要干擾游離mRNA的翻譯，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與調(diào)節(jié)細胞分化、增殖、凋亡，在肺動脈高壓(PAH)形成中起重要作用[1]。miR-17-92基因簇能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，誘導腫瘤血管增殖，且能調(diào)控骨形成蛋白Ⅱ型受體(BMPR2)表達。目前研究已表明，BMPR2與其配體結(jié)合后能明顯抑制血管平滑肌細胞的分化、增殖，與PAH形成密切相關(guān)[2,3]。miR-19a是miR-17-92基因簇最重要的成員之一，可誘導腫瘤血管形成及血管內(nèi)皮增殖，但其作用機制尚不明確。2016年3月～2017年11月，本課題擬構(gòu)建PAH動物模型，通過腺相關(guān)病毒(AAV)轉(zhuǎn)染miR-19a相關(guān)序列實現(xiàn)差異性表達，觀察miR-19a調(diào)控BMPR2與VEGF在PAH大鼠肺血管重構(gòu)中的作用，為PAH的治療提供新的靶點和手段。

1 材料與方法

1.1 主要材料 實驗動物：健康雄性SD大鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，均由西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供。主要試劑及儀器：miR-19a AAV質(zhì)粒(上海和元生物技術(shù)公司)；鼠抗BMPR2 IgG(1∶1 000，Bioworld)，鼠抗Tubulin IgG(1∶5 000，Proteintech)，HRP標記羊抗鼠IgG(1∶10 000，Proteintech)；總RNA提取試劑盒(上海華舜公司)，PCR試劑盒(北京天根生化科技公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)，BCA蛋白測定試劑盒(大連寶生物工程公司)。動物呼吸機(北京金洋萬達科技公司)，電泳儀(上海天能科技公司)，PCR儀(Applied Biosystems)，熒光定量PCR儀(杭州博日科技公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Biorad公司)，壓力換能器(北京新航興業(yè)科貿(mào)公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠PAH模型制備與分組轉(zhuǎn)染處理 24只大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定氣管導管接呼吸機，開胸切除左側(cè)全肺，均PAH造模成功(8周后均出現(xiàn)飲食、活動耐量降低，呼吸頻率升高，肺動脈管腔狹窄)。將模型大鼠隨機分為P0、P1、P2、P3組各6只，另取6只僅左側(cè)開胸作為假手術(shù)對照(C組)。P1、P2、P3組經(jīng)氣管分別導入滴度1×1012vg/mL的過載miR-19a AAV質(zhì)粒、封閉miR-19a AAV質(zhì)粒、空載miR-19a AAV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺組織，P0、C組均經(jīng)氣管導入等量生理鹽水。將各組分籠飼養(yǎng)于SPF級動物中心，喂養(yǎng)8周。

1.2.2 大鼠平均肺動脈壓力(mPAP)測定 各組用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剪開胸骨。用充滿肝素的頭皮針穿刺肺動脈主干，鏈接壓力換能器與生物機能實驗系統(tǒng)，記錄波形并計算mPAP。

1.2.3 肺動脈組織形態(tài)觀察及肺細小動脈平均中膜厚度(MT)測算 取各組完整右肺，部分以4%多聚甲醛固定24 h；石蠟包埋，連續(xù)5 μm厚切片。常規(guī)蘇木精伊紅染色，在顯微鏡下觀察肺動脈組織結(jié)構(gòu)改變，計算MT。

1.2.4 肺組織中miR-19a、VEGF mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。TRIzol冰上裂解大鼠肺組織后快速提取總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作得到cDNA，以此作為模板行實時熒光定量PCR。miR-19a、VEGF分別以U6、β-actin作為內(nèi)參，引物均由生工生物工程有限公司合成(見表1)，以2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

表1 miR-19a、VEGF及內(nèi)參引物序列

1.2.5 肺組織中BMPR2蛋白檢測 采用Western blotting法。將各組部分右肺組織置于含PMSF的裂解液中，4 ℃下以13 000 r/min離心5 min，取上清。BCA法測蛋白濃度，分別取20 μL蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉室溫搖床封閉30 min，一抗4 ℃搖床過夜，次日1×TBST漂洗5 min×3次；二抗TBST稀釋室溫孵育1 h，1×TBST漂洗5 min×3次。將膜置于Super ECL Plus超敏發(fā)光液2 min，暗室中膠片曝光，最后顯影、定影處理。掃描膠片后利用Quantity One圖像分析軟件分析條帶灰度，以BMPR2與butulin條帶灰度比值表示BMPR2蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組mPAP比較 C、P0、P1、P2、P3組mPAP分別為(15.36±2.31)、(26.42±1.32)、(33.57±2.85)、(20.10±0.94)、(25.74±1.31)mmHg,C組

2.2 各組肺動脈形態(tài)及MT比較 與C組比較，P0、P1、P2、P3組均有不同程度的內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)紊亂,肺動脈中膜增厚、管腔狹窄；與P3組比較，P1組血管重構(gòu)程度增強，而P2組血管重構(gòu)程度減弱，P0組無明顯變化。C、P0、P1、P2、P3組MT分別為5.4%±4.8%、20.1%±5.0%、35.1%±9.1%、13.4%±5.3%、18.4%±4.5%，C組

2.3 各組肺組織中miR-19a、VEGF mRNA表達比較 肺組織中miR-19a、VEGF mRNA表達C、P2組

表2 各組肺組織中miR-19a、VEGF mRNA表達比較

注：與C組比較，aP<0.05，bP<0.01；與P3組比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.4 各組肺組織中BMPR2蛋白表達比較 C、P0、P1、P2、P3組肺組織中BMPR2蛋白分別為0.96±0.20、0.42±0.13、0.55±0.12、1.1±0.42、0.46±0.07，P0、P1、P3組低于C、P2組(P<0.05或<0.01)。

3 討論

PAH是先天性心臟病最常見并發(fā)癥之一，具有高發(fā)病率和高病死率的特點，異常血流動力學導致的血管內(nèi)皮損傷、調(diào)節(jié)因子失衡是形成先心病肺動脈高壓(CHD-PAH)的關(guān)鍵因素[4]，但其潛在的分子機制知之甚少，治療方式局限。近年來，隨著對miRNA的深入認識，其已成為PAH的研究熱點。本實驗采用單側(cè)全肺切除構(gòu)建肺內(nèi)高血流狀態(tài)，用于模擬先天性心臟病異常血流動力學，以探索PAH的發(fā)生發(fā)展過程并尋找潛在的治療靶點。

本研究結(jié)果顯示，在單側(cè)全肺切除制備的PAH模型中miR-19a表達增加，表明miR-19a可能是PAH形成的重要調(diào)節(jié)因子,與陳偉丹等[5]的研究結(jié)果相符合。本實驗將攜帶過載miR-19a、封閉miR-19a、空載miR-19a序列的AAV質(zhì)粒通過呼吸道轉(zhuǎn)染至PAH大鼠肺組織中，結(jié)果顯示各組miR-19a表達出現(xiàn)明顯差異；轉(zhuǎn)染過載miR-19a后PAH大鼠mPAP、MT增加且肺血管重構(gòu)加重，而轉(zhuǎn)染封閉miR-19a后則出現(xiàn)相反的結(jié)果。這提示miR-19a對肺血管重構(gòu)起重要調(diào)節(jié)作用，可能是miR-19a影響了血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞的增殖。

BMPR2蛋白是BMP信號通路的膜受體，與其配體結(jié)合后實現(xiàn)細胞內(nèi)信號傳導[6]，可調(diào)控肺動脈平滑肌細胞內(nèi)效應蛋白的合成[7]，抑制平滑肌細胞等增殖，維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，誘導肺內(nèi)皮細胞中miR-17-92的表達上調(diào)，能夠明顯減少BMPR2蛋白表達，導致BMP信號通路受損[9，10]。由于miR-19a是miR-17-92基因簇的一員，查詢基因庫后發(fā)現(xiàn)BMPR2基因序列3′UTR端能與miR-19a的堿基序列互補，因此推測miR-19a能調(diào)控BMPR2的表達。本研究結(jié)果顯示，封閉miR-19a后PAH大鼠肺組織中BMPR2蛋白表達增加、MT降低。這表明封閉miR-19a可以促進BMPR2蛋白表達，并且激活BMP信號通路，抑制平滑肌細胞增殖能力，從而改善肺血管重構(gòu)，降低mPAP。而轉(zhuǎn)染過載miR-19a后，PAH大鼠肺組織中BMPR2蛋白表達降低，mPAP、MT升高；但與空載miR-19a大鼠比較，并未觀察到BMPR2蛋白進一步下降。這可能與BMPR2蛋白表達和生物活性與蛋白泛素化、溶酶體酶降解以及受多種miRNA調(diào)控等因素有關(guān)[11～13]，其機制還需進一步研究。

VEGF是一種強效促血管生成因子，而miR-17-92簇可增強VEGF促進內(nèi)皮增殖、新生血管形成[3]。本研究結(jié)果顯示，過載miR-19a后PAH大鼠肺組織中VEGF mRNA表達升高、肺血管重建明顯，而封閉miR-19a后結(jié)果則相反。這表明miR-19a可調(diào)節(jié)VEGF表達影響血管內(nèi)皮細胞的增殖活性，但VEGF引起細胞反應受多種因素的影響[14，15]。有研究表明，平滑肌細胞的增殖效應也可促進VEGF在自身中的表達，進而加重血管重構(gòu)[16]。本實驗結(jié)果顯示，當BMPR2表達降低時，VEGF mRNA表達量上升，兩者具有相反的趨勢。由此我們推斷，BMPR2表達減少后所導致的平滑肌細胞增殖，可能一定程度激活了VEGF表達，促進血管重構(gòu)，從而增加了肺血管阻力。

綜上所述，miR-19a能通過負性調(diào)控BMPR2的表達，影響肺動脈平滑肌的增殖及凋亡，同時又能調(diào)控VEGF，促使血管內(nèi)皮細胞的增殖，而BMPR2又與VEGF間可能存在相互作用的關(guān)系，在PAH形成過程中起關(guān)鍵作用，為CHD-PAH的臨床研究及治療提供了新的靶點。