穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽的合成及應(yīng)用

孫 雯，徐仲杰，羅 勇

(1.上?；ぱ芯吭河邢薰?，上海 200062；2.國(guó)家同位素工程技術(shù)研究中心 上海分中心，上海 200062)

穩(wěn)定同位素(2H、13C、15N和18O)標(biāo)記多肽及蛋白質(zhì)，作為定量蛋白質(zhì)組學(xué)中的“化學(xué)標(biāo)簽”，普遍應(yīng)用于生物樣品的檢測(cè)及示蹤等領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)的定量分析方法主要利用高分辨率質(zhì)譜，將同位素標(biāo)記和非標(biāo)記多肽離子或者肽段離子分開，利用其檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度值進(jìn)行定量計(jì)算[1]。合成穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽的主要方法有生物合成法和化學(xué)合成法，其中生物合成法是在動(dòng)物、植物、酶或者微生物生理代謝過程中對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記；化學(xué)合成法根據(jù)常規(guī)的化學(xué)反應(yīng)原理，通過使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的常規(guī)試劑代替非標(biāo)記的基礎(chǔ)試劑，利用化學(xué)合成的方法制備標(biāo)記目標(biāo)化合物[2]。

目前，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，基于質(zhì)譜技術(shù)的定量檢測(cè)方法逐漸發(fā)展成為生物分子量化關(guān)系研究的主流，其中同位素稀釋質(zhì)譜法利用其定量的優(yōu)勢(shì)在生物分子定量檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[3]。同位素稀釋質(zhì)譜法通常采用富含某種重質(zhì)同位素如2H、13C、15N和18O的試劑標(biāo)記待測(cè)肽段內(nèi)標(biāo)物，由于內(nèi)標(biāo)肽段與待測(cè)肽段的質(zhì)量數(shù)存在差異，因此在采用質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)試時(shí)其譜圖上顯示為質(zhì)荷比不同的兩個(gè)峰，兩個(gè)峰的間距由內(nèi)標(biāo)物被標(biāo)記重質(zhì)同位素的個(gè)數(shù)決定[4]。由于同位素稀釋質(zhì)譜法中使用的穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)化合物與待檢測(cè)的內(nèi)源性生物分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)幾乎完全相同，其色譜、質(zhì)譜行為也相同，因此可以有效消除基質(zhì)干擾及樣品前處理過程對(duì)檢測(cè)回收率的影響，是一種準(zhǔn)確、可靠的定量方法?；谏飿悠窓z測(cè)的同位素稀釋質(zhì)譜技術(shù)大多采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法，該方法充分結(jié)合了高效液相色譜的高選擇性和質(zhì)譜的高靈敏度，在對(duì)穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽進(jìn)行測(cè)定時(shí)無需衍生化，檢測(cè)流程簡(jiǎn)單[5]。但穩(wěn)定同位素標(biāo)記的多肽類內(nèi)標(biāo)化合物合成困難，使其應(yīng)用受到限制。本文結(jié)合近期國(guó)內(nèi)外研究成果，對(duì)穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽的合成和應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽的合成

1.1 生物合成法

1.1.1細(xì)胞代謝標(biāo)記法 Oda等[6]在1999年最早采用細(xì)胞代謝標(biāo)記多肽的方法，在大于96%15N豐度的環(huán)境中，輔助以半乳糖，在30 ℃條件下采用搖床培養(yǎng)酵母菌，獲得了15N標(biāo)記的多肽，并且利用質(zhì)譜中標(biāo)記多肽和非標(biāo)記多肽的質(zhì)量比例準(zhǔn)確測(cè)定了蛋白含量。此后，其他實(shí)驗(yàn)室也采用類似方法用其他的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記多肽的制備及檢測(cè)，如Conrads等[7]選擇的耐輻射球菌和老鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，Lanquar等[8]選擇的阿拉伯芥細(xì)胞，Pan等[9]選擇的沼澤紅假單胞菌等。最為特別的是Ong等[10]采用13CD3-蛋氨酸為標(biāo)記試劑，先轉(zhuǎn)化為13CD3-S-腺苷基甲硫氨酸，將其作為同位素的提供者，定量鑒定了59種甲基化蛋白。Phillip等[11]采用13C標(biāo)記的L-賴氨酸和L-精氨酸為碳源，喂養(yǎng)倉鼠卵巢細(xì)胞，獲得13C 標(biāo)記的人體免疫球蛋白(hIgG1)，其中13C標(biāo)記的L-賴氨酸和L-精氨酸片段的豐度高于99%。Zinn等[12]采用13C6-亮氨酸和13C6,15N4-精氨酸為原料，制備得到13C6,15N4標(biāo)記的多肽。Vidovic等[13]采用15NH4Cl為碳源喂養(yǎng)埃希氏桿菌，制備得到標(biāo)記15N多肽，該制備方法產(chǎn)率高、易純化。Liang等[14]采用亮氨酸-D3為原料，培養(yǎng)HEK 293T細(xì)胞，獲得標(biāo)記多肽。Jia等[15]采用15N標(biāo)記的Leu、Arg、Asp、Asn、Tyr和His等為原料，利用無細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成法制備得到了15N標(biāo)記多肽。李舒?zhèn)サ萚16]公布了一種通過、快速和可擴(kuò)展的方式來產(chǎn)生用于定量的標(biāo)記肽段的方法，將需要合成的肽段與strep-tag(WSHPQFEK)整合，利用無細(xì)胞的蛋白合成系統(tǒng)合成，經(jīng)過strep-tag的親和富集以及完全酶解后得到標(biāo)記的目標(biāo)肽段。

1.1.2高等真核生物標(biāo)記法 2003年Albert Heck實(shí)驗(yàn)室[17]制備了兩種15N標(biāo)記的有機(jī)體，秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅。線蟲用15N標(biāo)記的大腸桿菌喂養(yǎng)，果蠅幼蟲用15N標(biāo)記的酵母菌喂養(yǎng)。秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅的15N同位素豐度≥95%，可以用于蛋白的定量研究。2004年John Yates 實(shí)驗(yàn)室[18]公布了一種獲得15N標(biāo)記的小鼠肝臟蛋白方法，通過給小鼠喂養(yǎng)輔以高豐度的15N藻類且無蛋白的食物，經(jīng)代謝后獲得標(biāo)記肝臟蛋白，并將其作為內(nèi)標(biāo)使用。Mylne等[19]采用給白花蛇舌草喂養(yǎng)0.026% (15NH4)2SO4和0.026% K15NO3，得到15N 標(biāo)記的環(huán)肽化合物。Foldynová-Trantírková等[20]采用99.8%豐度的15N標(biāo)記纈氨酸喂養(yǎng)蜥蜴利什曼原蟲，廉價(jià)高效地得到了15N標(biāo)記多肽。

1.1.3酶催化標(biāo)記法 利用酶解反應(yīng)在多肽末端羧基上標(biāo)記18O同位素是常用的方法。Desiderio等[21]采用蛋氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽的五肽原料，在甲醇氯化氫和18O的體系中，于37 ℃下反應(yīng)一定時(shí)間得到18O標(biāo)記的蛋氨酸腦啡肽、亮氨酸腦啡肽以及兩者的酯化產(chǎn)物。Kristiansen等[22]采用胰蛋白酶在H218O條件下，水解膜組織獲得賴氨酸和精氨酸末端羧基被18O取代的多肽，用于診斷膽管癌。Fenselau等[23]采用絲氨酸蛋白酶做催化劑在 H218O條件下水解，得到18O標(biāo)記多肽。Bantscheff[24]和Miyagi[25]通過酶水解裂分也制備得到了18O標(biāo)記的多肽。18O同位素不僅可以通過酶水解加入還可以通過裂解后摻入。因此，蛋白質(zhì)可以在普通的環(huán)境中先消化，得到肽的干混合物后H218O才會(huì)被加入[26]。Carreira等[27]以H218O為原料，采用微波法制備18O標(biāo)記的多肽，提高了反應(yīng)效率，反應(yīng)時(shí)間從12～48 h縮短為30 min。李楠楠等[28]利用酶切產(chǎn)生的肽段溶液經(jīng)冷凍干燥后加入H218O復(fù)溶，同時(shí)加入質(zhì)量是底物1%的胰蛋白酶(H218O溶解)及最終質(zhì)量濃度為1 g/L的RapigestTM SF。于微波條件下反應(yīng)5 min，冷卻至室溫，循環(huán)30 min，得到18O同位素標(biāo)記定量肽段。錢小紅等[29]采用18O化學(xué)標(biāo)記與酶切入位點(diǎn)標(biāo)記相結(jié)合的方法，發(fā)明了一種利用穩(wěn)定同位素18O標(biāo)記蛋白質(zhì)組進(jìn)行雙重定量的新方法，該方法在N端肽段及C端肽段全部標(biāo)記的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)采用兩種18O穩(wěn)定同位素標(biāo)記同一樣本。

1.2 化學(xué)合成法

1.2.1乙?；瘶?biāo)記 乙?；饔没虬被囊阴；磻?yīng)標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、有效。例如Ji等[30]采用3倍量的N-乙酰氧基-D3-丁二酰亞胺和1 g/L多肽在pH=7.5的磷酸鹽緩沖溶液中室溫反應(yīng)4～5 h，經(jīng)反相色譜分離后，得到了乙?；?D3標(biāo)記的多肽。合成路線圖示于圖1。

圖1 乙酰化標(biāo)記氨基酸路線圖Fig.1 The synthesis route of acetylation labeling peptides

Zhang等[31]采用固定化的糖肽和丁二酰酸酐-D4反應(yīng)制備得到乙?；请?D4。Hsu等[32]利用還原胺化的原理，以裸露氨基的多肽為原料和氘代甲醛-D2反應(yīng)后，再經(jīng)氰基硼氫化鈉還原得到二甲基-D4標(biāo)記的多肽，合成路線圖示于圖2。

Boersema等[33]采用CD2O ,13CD2O為原料，二甲基化反應(yīng)標(biāo)記多肽，用于細(xì)胞和組織裂解物的研究。Raijmakers等[34]采用氘代甲醛為氘源，磷酸鹽為緩沖溶液，自動(dòng)連續(xù)地制備標(biāo)記多肽。

圖2 二甲基-D4標(biāo)記多肽合成路線圖Fig.2 The synthesis route of dimethylation labeling peptides

1.2.2標(biāo)記氨基酸縮合法 標(biāo)記氨基酸縮合法采用穩(wěn)定同位素D、13C、18O或15N標(biāo)記的氨基酸為基礎(chǔ)原料，使用高效縮合劑與其他標(biāo)記或非標(biāo)記的氨基酸通過化學(xué)反應(yīng)的方法合成穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽。

Breitung等[35]以13C/15N標(biāo)記的Fmoc-苯丙氨酸為原料，以wang樹脂為基體，羧基以苯甲基-2-磺酰三硝基三氮唑(MSNT)為活化試劑，利用二異丙基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑(DIC/HOBt)作為縮合劑，采用固態(tài)合成的方法[36-38]，逐步和13C/15N標(biāo)記的Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH反應(yīng)后制備得到標(biāo)記的NH2-Met-Leu-Phe-OH；還可以進(jìn)一步與甲酸乙酯反應(yīng)得到13C/15N標(biāo)記的甲?；?Met-Leu-Phe-OH[39]，反應(yīng)過程中可以采用克萊恩氏試驗(yàn)法保證產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率[40-41]。Dietz等[42]報(bào)道了一種簡(jiǎn)便的氘標(biāo)記絲氨酸二肽油脂合成方法，采用1-溴丁烷-D9為起始原料，經(jīng)過格氏反應(yīng)、烷基化、水解等10步反應(yīng)制備得到絲氨酸二肽油脂-D9。Pedersen等[43]采用氘代三乙胺和Pd(0)為氘源，得到酪氨酸-D4，進(jìn)而得到碘代-酪氨酸-D4-血管緊張肽(十肽)。Harris等[44]采用易于得到的二芐基保護(hù)[1,2,3,4,5-13C5, 2-15N1]-L-谷氨酸為起始原料，采用HBTU作為縮合劑，經(jīng)過三步反應(yīng)，高效地制備得到穩(wěn)定同位素標(biāo)記甘-脯-谷(GPE)三肽。Ghomashchi等[45]采用[1-13C, 2-13C, 3-13C,15N]-半胱氨酸、Fmoc-甘氨酸、wang樹脂等為原料，1-羥基苯并三唑(HOBt)、O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)為縮合劑，室溫固相合成了[1-13C, 2-13C, 3-13C,15N]-半胱氨酸-谷胱甘肽。Voronin等[46]采用13C6,15N標(biāo)記的亮氨酸為標(biāo)記原料，采用CEM多肽合成儀，微波條件下高效合成了VVSV{L}TVLHQDWLNGK十六肽，具體結(jié)構(gòu)示于圖3。

圖3 標(biāo)記合成16肽結(jié)構(gòu)圖
Fig.3 The chemical structure of labeling peptides

張亮等[47]介紹了一種穩(wěn)定同位素15N標(biāo)記八肽的合成方法，該方法采用固相合成，以Wang樹脂為載體、Fmoc保護(hù)的15N標(biāo)記氨基酸為前體，逐步合成，粗品經(jīng)剪切、純化后制得穩(wěn)定同位素15N標(biāo)記八肽，化學(xué)純度大于99%，同位素豐度大于97%；徐仲杰等[48]在專利中保護(hù)了一種穩(wěn)定同位素標(biāo)記α-乳白蛋白特征肽段(VGINYWLAHK)的合成方法，采用液相法進(jìn)行合成，前體為標(biāo)記纈氨酸，和經(jīng)Fmoc保護(hù)的非標(biāo)記或者標(biāo)記甘氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺等氨基酸進(jìn)行縮合、脫保護(hù)等一系列反應(yīng)，得到穩(wěn)定同位素標(biāo)記的目標(biāo)肽段，產(chǎn)品化學(xué)純度及同位素豐度均大于99%。在合成中不僅要考慮純度和收率，還要考慮工藝過程對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物豐度的影響。

穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑的豐度是決定試劑合成成敗的關(guān)鍵，要充分考慮合成試劑、反應(yīng)條件、環(huán)境因素等的影響，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的定位標(biāo)記選擇合適的同位素原料以及合成路線。生物合成法制備同位素標(biāo)記多肽，純度高，不存在旋光異構(gòu)體，但菌種的專有性強(qiáng)，很難適合不同多肽的合成，菌種的選育周期長(zhǎng)；有機(jī)合成法制備穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽，方法靈活，標(biāo)記的位置多樣，豐度容易控制，但容易產(chǎn)生消旋化合物，需要進(jìn)行拆分提純。在同位素標(biāo)記多肽的制備中要充分考慮應(yīng)用的需要，選擇合適的合成方法。

2 穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽的應(yīng)用

2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)定量

2.1.1乳制品檢測(cè) 穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段是同位素稀釋質(zhì)譜法的常用內(nèi)標(biāo)試劑，在乳制品的質(zhì)量控制中發(fā)揮了重要作用，如Ke等[49]采用CEV*F*R、NI*CNI*SCDK、LSFNPTQL*EEQCHI*(V*Val-OH-13C5,15N,F*Phe-OH-13C9,15N,I*Ile-OH-13C6,15N,L*Leu-OH-13C6,15N)等12種同位素標(biāo)記多肽做內(nèi)標(biāo)，建立了一種同時(shí)量化四種酪蛋白和兩種主要乳清蛋白的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜分析方法，定量分析了山羊和綿羊奶產(chǎn)品中牛奶和牛乳清粉的摻雜比例，并將該方法成功應(yīng)用于不同商業(yè)品牌的羊乳配方奶粉的測(cè)試，結(jié)果表明該方法表現(xiàn)出高的專一性和準(zhǔn)確性。黃棣華[50]發(fā)明公開了一種氨基酸序列為L(zhǎng)SQSKVL*PV*PQK的酪蛋白磷酸肽的內(nèi)標(biāo)肽，其中L*和V*為碳氮全同位素標(biāo)記的氨基酸殘基。選擇酪蛋白磷酸肽中的一種特征肽作為檢查目標(biāo)，對(duì)奶制品中酪蛋白磷酸肽進(jìn)行定量檢測(cè)，該特征肽在酪蛋白磷酸肽中最具代表性，含量相對(duì)穩(wěn)定，再加入內(nèi)標(biāo)肽對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正，該方法的線性好、回收率高、準(zhǔn)確性好。張京順[51]采用同位素稀釋質(zhì)譜法，同時(shí)利用牛胰蛋白酶對(duì)總α-乳白蛋白、總牛乳鐵蛋白和總β-乳球蛋白進(jìn)行酶解，并對(duì)其特異標(biāo)簽肽進(jìn)行優(yōu)化，使其成為具有與待測(cè)蛋白本身相近酶解效率、色譜和質(zhì)譜行為的內(nèi)標(biāo)物；通過蛋白與內(nèi)標(biāo)肽之間摩爾關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)三種蛋白的準(zhǔn)確定量，該方法測(cè)試條件下三種蛋白的平均回收率分別為95.8%～100.6%、92.04%～100.67%和92.04%～109.91%；結(jié)果表明，建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性及靈敏度好，適用于嬰幼兒食品以及乳制品中的總α-乳白蛋白、牛乳鐵蛋白和β-乳球蛋白含量的測(cè)試。

2.1.2生物蛋白定量 李楠楠等[28]建立了定量肽段串聯(lián)體蛋白質(zhì)結(jié)合18O標(biāo)記-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行絕對(duì)定量的新方法，該方法采用酶促18O同位素標(biāo)記輕標(biāo)表達(dá)的Qcon CAT蛋白質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，通過對(duì)騰沖嗜熱厭氧菌中選定的蛋白肽段進(jìn)行絕對(duì)含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<20%，解決了穩(wěn)定同位素標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸(SILAC)技術(shù)中標(biāo)記試劑價(jià)格昂貴的問題，同時(shí)也對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)絕對(duì)定量方法的發(fā)展起了推動(dòng)作用。Kilpatrick等[52]采用同位素稀釋質(zhì)譜建立了準(zhǔn)確定量人體血清中C反應(yīng)蛋白的方法，該方法以15N標(biāo)記人體C反應(yīng)蛋白為內(nèi)標(biāo)，與商品化的C反應(yīng)蛋白檢測(cè)方法相比，更準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)人體健康狀況。Konopka等[53]基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)同位素稀釋質(zhì)譜法以完整的標(biāo)記蛋白做內(nèi)標(biāo)，對(duì)16對(duì)同位素標(biāo)記和非標(biāo)記的肽段進(jìn)行準(zhǔn)確定量，在常用的非標(biāo)記與標(biāo)記肽段質(zhì)量比例計(jì)算的基礎(chǔ)上，探討蛋白摩爾比計(jì)算方法。Burkitt等[54]將基于肽段的同位素稀釋質(zhì)譜法應(yīng)用到蛋白質(zhì)絕對(duì)定量研究中，通過使用已知純度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)肽段的絕對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，使蛋白質(zhì)的測(cè)定結(jié)果可溯源至國(guó)際單位制(SI)。李舒?zhèn)サ萚16]發(fā)明了一種應(yīng)用于蛋白質(zhì)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段合成及定量方法，通過對(duì)已知蛋白的代表性的肽段進(jìn)行母離子/子離子的選擇，在待分析物中加入已知量的同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽段并結(jié)合其標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)某個(gè)或某些目標(biāo)蛋白的絕對(duì)定量。

2.1.3蛋白測(cè)序及藥物代謝 Kaiser等[55]采用D7-VHLTPE和 D7-1-deoxyfructosyl-VHLTPE做內(nèi)標(biāo)，建立了血紅蛋白A1c測(cè)序的基礎(chǔ)方法，通過與國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)指定方法對(duì)比，相對(duì)偏差為3.4%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為4.9%，絕對(duì)偏差為(0.5～3.9) mmol/mol(0.05%～0.35%)。張麗華等[56]發(fā)明了一種基于多肽兩端非等重穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測(cè)序方法，使用含有同位素標(biāo)記賴氨酸的培養(yǎng)液實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)中賴氨酸的標(biāo)記，利用高效液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分離和鑒定。劉喜東等[57]采用質(zhì)譜法以酶切型穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段做內(nèi)標(biāo)，分別采用在酶解前加入帶酶切位點(diǎn)的標(biāo)記肽段、不帶酶切位點(diǎn)的標(biāo)記肽段及在酶解過程后、質(zhì)譜檢測(cè)前加入不帶酶切位點(diǎn)的標(biāo)記肽段進(jìn)行樣品前處理；結(jié)果表明，采取第一種方式處理樣品可減小蛋白質(zhì)絕對(duì)定量分析的誤差，使測(cè)定結(jié)果更接近真實(shí)值，提高了分析結(jié)果的重現(xiàn)性。Ong等[58]研究了采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸法完全取代13C標(biāo)記精氨酸，用氘代亮氨酸作為標(biāo)記物對(duì)肌肉組織蛋白質(zhì)進(jìn)行代謝標(biāo)記，對(duì)肌肉分化過程中蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行定量。

2.2 食品過敏原檢測(cè)

當(dāng)前，過敏性疾病已成為全球新的問題，據(jù)統(tǒng)計(jì)，90%左右的食品過敏反應(yīng)是由花生、乳制品、小麥、海鮮、大豆等8類食物引起，其中花生引起的過敏反應(yīng)居多，因此對(duì)食品過敏原進(jìn)行篩選并準(zhǔn)確定量意義重大。Sepp?l?等[59]將同位素稀釋質(zhì)譜法應(yīng)用到梯牧草花粉過敏原的絕對(duì)定量中，該研究使用高分辨、高精確質(zhì)譜，使測(cè)定結(jié)果的日間變異系數(shù)小于5%。Careri等[60]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，以生物標(biāo)記肽段做內(nèi)標(biāo)，用于確定和量化食品中的花生蛋白過敏原Arah2和Arah3/4，在對(duì)四種生物標(biāo)記多肽的選擇性進(jìn)行考察的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了花生蛋白過敏原Arah2及Arah3/4色譜、質(zhì)譜測(cè)試條件。同時(shí)采用液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法對(duì)食品基質(zhì)米脆和巧克力中的Arah2與Arah3/4進(jìn)行檢測(cè)，獲得良好的檢測(cè)限。Newsome等[61]以完整的牛15N-α-S1-casein做內(nèi)標(biāo)，在質(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式下對(duì)烘焙用材料(包括動(dòng)植物油、糖、食用膠)中牛奶蛋白進(jìn)行測(cè)試。Weber等[62]利用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜建立了測(cè)定食品基質(zhì)中酪蛋白的方法，該方法采用同位素標(biāo)記酪蛋白做內(nèi)標(biāo)，以胰蛋白酶消化食品基質(zhì)提取液，用于檢測(cè)牛奶過敏原。Shefcheck等[63-64]采用液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜，建立了冰淇淋基質(zhì)中生物標(biāo)記肽過敏原的檢測(cè)方法；并將該方法應(yīng)用于含有不同水平花生蛋白的冰淇淋樣品檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)表明，該方法對(duì)花生過敏原蛋白Arah1的定量檢測(cè)限為10 μg/g。同時(shí)使用相似方法，通過對(duì)巧克力樣品前處理技術(shù)的改進(jìn)和樣品量的增加使花生蛋白的檢出限降低到2 ppm。王洋[65]采用同位素稀釋質(zhì)譜法，以13C5-脯氨酸、13C5-纈氨酸及13C5-苯丙氨酸做內(nèi)標(biāo)，對(duì)蛋白質(zhì)過敏原純品的含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，同時(shí)驗(yàn)證了采用同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定β-乳球蛋白、β-酪蛋白、乳鐵蛋白及溶菌酶純品蛋白含量的準(zhǔn)確性，且其測(cè)定結(jié)果可溯源到SI。

3 小結(jié)

隨著同位素稀釋質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展及在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用，穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽和蛋白質(zhì)的研制，將進(jìn)一步推動(dòng)多肽的精準(zhǔn)定量，同時(shí)降低分離難度，有效消除基質(zhì)干擾，提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，該檢測(cè)方法將有望納入法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)記多肽及蛋白質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)在食品檢測(cè)、生物蛋白定量、蛋白測(cè)序、藥物代謝、過敏原檢測(cè)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，將會(huì)進(jìn)一步推動(dòng)穩(wěn)定同位素標(biāo)簽技術(shù)在新藥研發(fā)、臨床病理、蛋白質(zhì)組學(xué)、食品安全等領(lǐng)域的快速發(fā)展。例如在食品過敏原的檢測(cè)中，基于同位素稀釋技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法正被用于廣泛替代傳統(tǒng)的免疫化學(xué)法；而在代謝組學(xué)中由于穩(wěn)定同位素標(biāo)記示蹤技術(shù)，能夠隨時(shí)追蹤含有同位素標(biāo)記的多肽在體內(nèi)或體外位置及數(shù)量的變化情況，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中。因此，針對(duì)不同領(lǐng)域的需求開展穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽合成技術(shù)的研究在未來將大有可為。