攣縮肢體深筋膜中Ⅰ型膠原的表達

薛書生，笪 虎，吳 琪，趙鳳朝

0 引 言

肢體骨折后，骨折斷端常發(fā)生重疊，肢體短縮。如不能早期恢復肢體的長度，患肢活動受限，肌肉組織受到張力變小，易出現(xiàn)制動性攣縮。經(jīng)過一段時間后，行二期手術時，術中肢體將不易牽拉、延展，影響骨折斷端的復位及術后肢體功能恢復[1]。為了恢復骨折處正常對位關系，術者常需要做廣泛軟組織的松解，如骨膜剝離等。骨骼的血供受到破壞，常引起骨折愈合延遲甚至骨不連等后果[2]。在皮膚、肌肉、肌腱、筋膜等組織中，Ⅰ型膠原蛋白是最主要的膠原蛋白，其直徑粗大、具有較強的抗張能力[3-4]。故我們推測軟組織不易被拉伸，應與Ⅰ型膠原蛋白表達的改變有密切關系。本研究選取兔后肢股部的深筋膜組織為研究對象，通過研究攣縮肌肉組織的深筋膜表達Ⅰ型膠原的變化，來分析攣縮的肌肉延展性變差的原因，為肢體骨折二期手術前行牽引、維持肢體長度的處理，提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料24月齡以上健康新西蘭大白兔40只，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg，均由南京青龍山動物繁育場提供[實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2017-0011]；戊巴比妥鈉(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司)；四甲基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(上?；蛏锕こ逃邢薰?；兔抗兔單抗、辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG(上海遠慕生物科技有限公司)；總RNA提取(TRIzol)試劑(omga公司，美國)；DNA酶消化試劑盒、反轉錄酶試劑盒(TaKaRa公司，日本)；熒光定量PCR分析儀(Applied-Biosytems，美國)；苦味酸飽和水溶液(1.22%)(上海遠慕生物科技有限公司)；天狼猩紅(Sirius Red，中國國藥集團化學試劑有限公司)；偏振光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i )、OLYMPUS CX41 顯微鏡、CANON DS16275 數(shù)碼相機。

1.2方法

1.2.1兔股骨重疊骨折模型的制作將每只兔的右后肢分配至實驗組，左后肢分配至對照組。肌注麻醉兔后，人為折斷右側股骨干中段，使之完全性骨折。由于肌肉的收縮，骨折斷端自動處于重疊短縮狀態(tài)。兔麻醉清醒后，置于籠內(nèi)自由活動。實驗對動物的處理方法符合國家科學技術部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》[5]。

1.2.2深筋膜組織的取材于兔股骨骨折后1個月和2個月，各自隨機選取20只兔子。耳緣靜脈注射空氣處死后，迅速切取雙后肢股部外側中段深筋膜。

1.2.3深筋膜組織的苦味酸天狼猩紅染色將切取的標本立即置于10%甲醛固定24 h后，石蠟包埋、切片，切片厚約4 μm，繼而脫蠟至水，浸染于苦味酸天狼猩紅溶液1 h。水洗后蘇木精復染核，脫水、透明、封片，于偏振光顯微鏡下觀察。

1.2.4SP法免疫組化檢測筋膜組織中Ⅰ型膠原表達將切片脫蠟至水，PBS沖洗3 min×3次。用稀釋后的高pH脫蠟抗原修復液修復后，PBS沖洗。3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS沖洗。滴加山羊血清工作液，室溫下孵育15 min，吸去多余液體。滴加1∶100兔源抗兔Ⅰ型膠原抗體，孵育60 min。PBS沖洗5 min×3次，滴加生物素標記山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min。PBS沖洗后，滴加辣根過氧化酶標記鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育10 min。PBS沖洗后，以DAB顯色劑顯色。水冼后，復染、脫水、透明、封片。切片在顯微鏡下觀察，見Ⅰ型膠原免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，位于深筋膜細胞膜外。每張切片內(nèi)任選5個視野(800×)，采用EMAL200真彩圖像分析系統(tǒng)對免疫組化陽性染色強度進行半定量分析，測量每張切片陽性染色的平均灰度值。

1.2.5Westernblot方法檢測Ⅰ型膠原表達2組各取20份骨折后1個月和2個月的新鮮后肢股部中段外側深筋膜，共80份，每份質量約10 mg左右。經(jīng)蛋白裂解液裂解后，提取組織總蛋白。然后加入上緩沖液，100 ℃煮沸30 min。采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠分離電泳(PAGE)，再將蛋白質轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，使用封閉液封閉過夜。室溫下，使用兔抗兔一抗孵育2 h, TBST清洗3次；羊抗兔二抗孵育2 h，TBST清洗3次。最后，利用ECL顯色，曝光。采用ImageQuant TL圖像分析系統(tǒng)測定Western blot條帶A值，并與內(nèi)參照β-actin的測定值進行比較，計算A比值，進行半定量分析。

1.2.6RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原的mRNA表達將2組各40份質量約10 mg左右的新鮮兔后肢股部深筋膜在冰上的低溫條件下進行研磨，然后分別加入0.5 mL TRIzol試劑，按TRLzol試劑說明書進行RNA的提取。cDNA合成參照反轉錄試劑盒說明書進行。產(chǎn)物存于-20 ℃?zhèn)溆?。檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中Ⅰ型膠原全長mRNA序列，應用Primier 5.0軟件，委托TaKaRa寶生物工程(大連)股份有限公司合成Ⅰ型膠原基因以及內(nèi)參GAPDH基因的上下游引物，引物序列為GAPDH(正向: 5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′，下游:5′-CACAATGCCGAAGTGGTCGT-3′)；Ⅰ型膠原蛋白引物正向: 上游: 5′-GGTTACGACTTTGGTTATGA-3′，下游: 5′-GGAGGGTCTCAATCTGGTTG-3′)[6]。并用NCBI中的Blast程序進行核酸序列相似性比較和引物特異性分析取反轉錄產(chǎn)物cDNA 1 μL為模板，采用(大連寶生物公司) 2×SYBR Premix DimerEvaser建立反應體系，將各反應管放入熒光定量PCR儀，按下列條件擴增：95 ℃ 30 s，然后40個循環(huán)按95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,讀板，以GADPH作為內(nèi)參照，用Light Cycler Software Ver. 4.0分析目的基因的相對表達水平。

2 結 果

2.1深筋膜組織的天狼猩紅染色深筋膜組織經(jīng)天狼猩紅染色后，在偏振光顯微鏡下觀察，見深筋膜組織內(nèi)的細胞外基質中Ⅰ型膠原呈鮮艷的猩紅色，有較強的雙折射光。對照組的Ⅰ型膠原纖維束有明顯的定向性，密度稍大、形態(tài)偏長，而實驗組的定向性較差，密度稍小、形態(tài)較短。見圖1。實驗組骨折后1個月和2個月的Ⅰ型膠原纖維長度均明顯小于對照組(P<0.01)，見表1。

圖1 鏡下觀察骨折后兔深筋膜內(nèi)Ⅰ型膠原纖維表達(天狼猩紅染色 ×400)

2.2深筋膜組織的Ⅰ型膠原蛋白免疫組化染色深筋膜組織的切片經(jīng)Ⅰ型膠原免疫組化染色后，在顯微鏡下觀察，見細胞內(nèi)和細胞外的中Ⅰ型膠原蛋白呈棕黃色，實驗組的棕黃色染色明顯淺于對照組，見圖2。實驗組骨折后1個月和2個月深筋膜Ⅰ型膠原蛋白免疫組化染色所產(chǎn)生的棕黃色的平均灰度值均明顯高于對照組(P<0.05)，見圖3。

組別n不同時間Ⅰ型膠原纖維長度1個月2個月對照組2081.7±13.483.5±14.6實驗組2058.3±18.551.1±16.2t值2.52.9P值<0.01<0.01

圖2 骨折后兔深筋膜內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白表達(免疫組化染色 ×800)

與對照組比較，*P<0.05圖3 骨折后不同時間兔深筋膜Ⅰ型膠原免疫組化染色灰度值比較

2.3Westernblot檢測Ⅰ型膠原的表達實驗組骨折后1個月和2個月深筋膜組織中Ⅰ型膠原的表達均顯著低于對照組(P<0.05)，見圖4。

1、2：實驗組術后1個月、2個月；3、4：對照組術后1個月、2個月與對照組比較，*P<0.05圖4 Western blot法檢測骨折后深筋膜內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白表達比較

2.4RT-PCR法檢測深筋膜Ⅰ型膠原蛋白的mRNA表達RT-PCR結果顯示，實驗組骨折后1個月和2個月的Ⅰ型膠原蛋白mRNA的相對表達量均顯著低于對照組(P<0.05)，見圖5。

與對照組比較，*P<0.05圖5 PCR法檢測骨折后深筋膜內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的mRNA的相對表達量比較

3 討 論

膠原蛋白是由三條肽鏈擰成的螺旋形纖維狀大分子蛋白質，作為一種細胞外基質廣泛存在皮膚、肌腱、筋膜等組織中，由于這一長且堅韌的特殊構型，使這些組織富有彈性，在保持組織整體功能方面發(fā)揮著重要生物力學作用[7]。膠原蛋白是一個有多達十余種成員的蛋白質家族，其中Ⅰ型膠原蛋白含量最多，約占生物體膠原總量的90%。Ⅰ型膠原蛋白直徑較為粗大，主要作用是吸收和傳遞應力，具有較強的抗張能力[8-9]。

在對發(fā)生四肢制動性攣縮的骨傷患者行Ⅱ期手術時，發(fā)現(xiàn)術中軟組織抗拉伸能力增加，特別是深筋膜、肌膜、肌腱等纖維結締組織發(fā)生攣縮、粘連，不易伸展，進而影響到骨折短縮畸形的矯正及術后肢體功能的恢復。由于Ⅰ型膠原蛋白是纖維結締組織的最主要的抗張力蛋白，故本研究推測，發(fā)生制動性攣縮的肢體軟組織抗拉伸能力增加，可能與肢體筋膜、肌膜、肌腱等組織的Ⅰ型膠原蛋白表達有著密切相關性。

在本研究中，我們選取兔后肢股部的深筋膜為研究對象，右側股骨發(fā)生重疊、短縮性骨折。骨折1個月和2個月后，右后肢股部肌肉組織發(fā)生制動性攣縮。切取右后肢股部中段外側深筋膜，并置于實驗組，左后肢股部相應部位的深筋膜置于對照組。天狼猩紅染色可見實驗組的Ⅰ型膠原蛋白組成的纖維束定向性較差，并且長度變短。進行型膠原蛋白免疫組化染色，并用EMAL200真彩圖像分析系統(tǒng)分析棕黃色的灰度值；采用Western blot法檢測Ⅰ型膠原蛋白的表達；還采用RT-PCR法檢測型膠原蛋白mRNA的表達。以上結果提示：無論在骨折后1個月還是2個月，實驗組深筋膜的型膠原蛋白的量及其mRNA的表達均顯著低于對照組(P<0.05)，即攣縮的深筋膜表達型膠原蛋白明顯減少。

本研究開始之前，我們認為由于Ⅰ型膠原蛋白具有較強的抗張能力，發(fā)生制動性攣縮的肌肉不易被拉伸時，Ⅰ型膠原蛋白表達應該增加，而結果卻與我們之前的設想截然相反。出現(xiàn)這一個結果應該是由于制動導致肢體中Ⅰ型膠原蛋白分解代謝和合成失衡所造成的[10]。但這并未能對筋膜等軟組織延展性能下降給出一個合理解釋。經(jīng)過仔細觀察與分析，認為在實驗前我們混淆了組織的延展性與剛性這兩個概念。延展性，即韌性，是指組織受力時發(fā)生變形的能力；而剛性，即強度，是指組織在受力時抵抗變形的能力。

有研究表明，對于包括筋膜組織在內(nèi)的任何彈性材料而言，“胡克定律”和“彈性模量(E)”均能夠反映出其最基本的彈性行為方式[11]。在材料彈性限度內(nèi)，其應力與應變成正比例關系，即胡克定律，其比值被稱為材料的彈性模量(E)[12-13]。E=σ/ε，σ為應力，ε為應變。目前彈性模量作為軟組織力學性能重要參數(shù)之一，已經(jīng)得到較為廣泛的研究和測量，例如足部肌肉及肌腱等組織[16-17]。有研究顯示當皮膚等組織中膠原蛋白含量增加時組織的韌性也相應提高，反之，當組織中膠原蛋白含量減小時組織的韌性也下降[11,16]。有學者研究表明彈性體韌性與彈性模量(E)成負相關關系，韌性越大的組織拉伸彈性模量越小[17-18]。由于攣縮肢體筋膜等結締組織中Ⅰ型膠原蛋白含量下降導致韌性下降，在韌性下降同時組織的拉伸彈性模量(E)增大。根據(jù)E=σ/ε公式，當收到相同應力σ(縱向牽引力)作用時，隨著組織彈性模量(E)增大，發(fā)生應變量ε(拉伸長度)將變小。因此與新鮮骨折相比，當骨折肢體發(fā)生制動性攣縮時，由于膠原蛋白含量減少導致拉伸彈性模量變大，使得軟組織難以牽拉、伸展。故而實驗中得出的“Ⅰ型膠原蛋白表達下降”的結論，與臨床上所見肌肉組織攣縮后延展性能下降的現(xiàn)象，是完全契合的。

發(fā)生制動性肌肉攣縮的骨傷患者，軟組織延展性差，是多種因素共同作用的，包括皮膚、肌肉纖維、肌膜、肌內(nèi)膜、肌腱組織的因素，還有其他組織成分表達改變的因素[19]。本研究只單純檢測了深筋膜組織中Ⅰ型膠原蛋白表達的改變，沒有對作用力大小、組織拉伸度等具體量化，具有顯著的局限性，是本研究不足之處，有待于我們進一步研究。

綜上所述，肌肉組織在發(fā)生制動性萎縮時，由于Ⅰ型膠原蛋白的表達變小導致組織彈性模量增加，延展性下降，導致術中肌肉組織不易于被牽拉、伸展。這為臨床工作中對于不能早期手術的肢體骨折患者，進行適當牽引，盡量維持肢體長度，減輕肢體攣縮程度，降低Ⅱ期手術難度和減小手術創(chuàng)傷提供了理論依據(jù)。

(致謝: 感謝解放軍第八二醫(yī)院王連麗老師以及南京總醫(yī)院馬恒輝、張明超老師對本實驗提供的幫助。)