小鼠腸上皮細胞巖藻糖基化與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)生的關(guān)系

杜華，佘香，余加林，胡坤，賀雨，肖灑，艾青，劉東

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生兒期一種嚴重威脅患兒生命的疾病[1]。近年來隨著極低出生體重兒存活率的提高，NEC的發(fā)病率有逐漸升高的趨勢，活產(chǎn)兒為1‰～3‰，占NICU患兒的2%～5%，其中90%以上為早產(chǎn)兒，病死率高達20%～40%，存活者也常常遺留短腸綜合征、營養(yǎng)不良等后遺癥，給家庭和社會帶來了嚴重負擔(dān)[2-3]。目前研究認為NEC是一種多因素疾病，腸道菌群改變與其發(fā)生關(guān)系密切[4-5]，而腸黏膜中與菌群接觸最密切的是腸上皮層[6-7]，近年來有大量研究表明腸上皮多糖在宿主與菌群的相互作用中扮演著重要角色，腸上皮的糖基化水平可由菌群刺激和腸道免疫系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)，上皮多糖也參與腸道菌群穩(wěn)態(tài)的維持，其中腸上皮細胞巖藻糖基化在腸道共生菌定植中意義重大[8-9]。近年Goto等[10]研究發(fā)現(xiàn)腸上皮細胞巖藻糖基化水平主要通過菌群與腸道3型天然淋巴細胞(group 3 innate lymphoid cells，ILC3s)的相互作用(ILC3s-IL-22-Fut2軸)進行調(diào)節(jié)。本研究旨在探討腸上皮細胞巖藻糖基化水平改變是否參與了NEC的發(fā)病，并初步分析其可能的機制，為進一步闡明菌群與NEC發(fā)生的因果關(guān)系提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 10日齡的C57BL/6新生小鼠42只(6只SPF級C57BL/6孕鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，中國)。

1.1.2 主要試劑 Similac配方奶(雅培公司，美國)，貝克幼犬配方奶(貝克公司，美國)，HBSS平衡鹽溶液、胎牛血清(Gibco，美國)，EDTA、膠原酶、DNA酶(Sigma，美國)，DTT(VETEC，美國)，RPMI 1640 培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，F(xiàn)ixation/Permeabilization、Permeabilization Buffer套裝(Ebioscience，美國)，RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)，Supermix EvaGreen(Bio-Rad，美國)，Mouse IL-22 ELISA Kit(RayBiotech，美國)，7AAD、RORγt-PE(BD，美國)，CD45-BV605、CD45-APC、Lineage Cocktail-BV421(BioLegend，美國)，UEA1-DyLight649(VECTOR，美國)。

1.1.3 主要儀器 CANTO-Ⅱ流式細胞儀(BD，美國)，加樣槍、小型臺式離心機(Eppendorf，德國)，低溫高速離心機(Thermo，德國)，NanoDrop 2000(Thermo，德國)，CFX96 Real-time PCR儀(Bio-Rad，美國)，切片機(Leica，德國)，普通光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)，電子分析天平(COBOS，西班牙)。

1.2 方法

1.2.1 NEC動物模型的建立 將42只10日齡的C57BL/6新生小鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為NEC組(n=21)和對照組(n=21)。其中NEC組給予配方奶人工喂養(yǎng)，喂養(yǎng)量0.03ml/g，每4h喂養(yǎng)1次，缺氧冷刺激(100%氮氣箱內(nèi)缺氧30s，4℃冷刺激10min)每日2次[11]；對照組由母鼠哺乳，不做其他處理。每日喂養(yǎng)前記錄新生鼠體重并觀察有無吐奶、腹脹、腹瀉和血便，活動狀態(tài)是否良好等。建模3d后(13日齡)斷頭法處死新生鼠。

1.2.2 腸組織病理染色 將新生鼠處死后，分離腸組織，肉眼觀察有無腸腔積氣、出血、壞死等NEC樣病變，用PBS沖洗腸段。取出回腸末端近回盲部腸組織，用4%多聚甲醛固定過夜。將固定好的標(biāo)本脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)并拍照。參照NEC損傷評分標(biāo)準，采用雙盲法進行腸組織病理評分[12]，每例組織標(biāo)本觀察3個視野，取其平均值，評分≥2分認為NEC建模成功。

1.2.3 小鼠腸道細胞分離 將回腸末端近回盲部腸組織取出后，用預(yù)冷的PBS灌洗，腸內(nèi)容物洗凈后，將腸道縱行剖開，剪成1cm左右小段，將腸組織放于含有EDTA、DTT的不含鎂鈣的HBSS平衡鹽溶液中，37℃孵育15min后過濾，4℃、400×g離心10min得到腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IEC)。將剩余組織轉(zhuǎn)入含有2mg/ml膠原酶和10%FBS的RPMI 1640中，37℃震蕩孵育40min后過濾，將細胞懸液通過Percoll淋巴細胞提取液，經(jīng)密度梯度離心及PBS洗滌后，得到腸固有層淋巴細胞(lamina propria lymphocyte，LPL)。

1.2.4 流式細胞技術(shù)檢測巖藻糖基化腸上皮細胞(fucosylated ECs，F(xiàn)-ECs)和腸道固有層ILC3s數(shù)量保證每管上樣細胞數(shù)約為2×106個，上樣體積200μl，標(biāo)記策略：F-ECs：7AAD陰性，CD45-BV605陰性，UEA1-DyLight649陽性；ILC3s：7AAD陰性，CD45-APC陽性，CD3/4/11/19-BV421陰性，RORγt-PE陽性。細胞標(biāo)記后用CANTO-Ⅱ流式細胞儀上機檢測，使用FlowJo V10軟件分析結(jié)果。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測IL-22、IL-22R、Fut2水平 使用RNAiso Plus裂解上皮細胞和固有層淋巴細胞，分別提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所有步驟嚴格按照試劑盒說明書操作，將cDNA在CFX96 Real-time PCR儀上進行擴增，分別檢測腸上皮細胞IL-22R、Fut2和固有層淋巴細胞IL-22的表達水平。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s、56.5℃退火5s、65℃延伸5s，共39個循環(huán)。反應(yīng)引物序列如表1所示。采用2–ΔΔCt法進行目的基因相對表達量分析。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primers of real-time PCR

1.2.6 ELISA檢測腸固有層淋巴細胞IL-22蛋白水平

從液氮中取出凍存的腸固有層淋巴細胞，用含有2% FBS的PBS洗滌，4℃、500×g離心10min后，按照1×106個細胞加入200μl細胞裂解液的比例加入含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和PMSF的細胞裂解液，4℃震蕩，12 000×g離心5min，取上清液為全蛋白提取物。采用ELISA檢測IL-22蛋白表達水平，所有步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。使用Shapiro-Wilk檢驗進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布的計量資料以M(Q)表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NEC建模對新生鼠體重的影響 建模前和建模第1天兩組新生鼠體重?zé)o明顯差異；建模第2天[(4.21±0.62)gvs.(3.32±0.11)g，P＜0.01]和第3天[(4.27±0.72)gvs.(3.17±0.11)g，P＜0.001]，NEC組新生鼠體重明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

圖1 NEC及對照組新生鼠體重比較Fig.1 Body weight of neonatal mice in NEC and control group

2.2 腸組織大體形態(tài)、病理形態(tài)觀察及病理損傷評分 肉眼觀察，對照組腸管色澤粉嫩，呈黃色，彈性佳，無積氣等表現(xiàn)；NEC組色澤暗淡，彈性差，回盲部以上呈串珠樣積氣改變。光鏡下觀察，對照組腸道結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，腺體排列規(guī)則，絨毛高聳整齊；NEC組固有層和黏膜下層斷裂分離，部分絨毛脫落消失，腺體排列紊亂，肌層變薄甚至斷裂，雙盲法病理學(xué)評分為2.76±0.42分(圖2)。

圖2 對照組及NEC組新生小鼠腸組織的大體形態(tài)和病理形態(tài)比較Fig.2 Gross morphology and pathomorphology of intestinal tissue of neonatal mice in control and NEC group

2.3 F-ECs和腸道固有層ILC3s數(shù)量 流式細胞計數(shù)結(jié)果顯示，NEC模型組F-ECs百分比(28.41%±8.28%)低于對照組(43.60%±13.58%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖3，CD45陰性、UEA-1陽性群為目標(biāo)細胞)；NEC模型組腸道固有層ILC3s百分比(11.59%±2.25%)也明顯低于對照組(20.14%±4.27%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，圖4，CD3/4/11/19陰性、RORγt陽性群為目標(biāo)細胞)。

圖3 對照組及NEC組F-ECs比例(流式細胞儀)Fig.3 F-ECs ratio in control and NEC group (Flow cytometry)(1)P＜0.05 compared with control group

圖4 對照組及NEC組腸道固有層ILC3s比例(流式細胞儀)Fig.4 Intestinal lamina propria ILC3s ratio in control and NEC group (Flow cytometry)(1)P＜0.001 compared with control group

2.4 NEC建模對上皮細胞IL-22R、Fut2和固有層淋巴細胞IL-22 mRNA表達水平的影響 NEC模型組上皮細胞IL-22R mRNA表達水平(0.31±0.07vs.1.00±0.29)和Fut2 mRNA表達水平(0.33±0.13vs.1.00±0.22)明顯低于對照組(P＜0.001)；NEC模型組固有層淋巴細胞IL-22 mRNA表達水平(M=0.02)也明顯低于對照組(M=1.15)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.5 兩組腸道固有層淋巴細胞IL-22蛋白表達水平比較 ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組(7.97±0.10)相比，NEC模型組固有層淋巴細胞IL-22蛋白表達水平(6.91±0.14)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。

3 討 論

NEC的高發(fā)病率和高病死率嚴重威脅著新生兒尤其是早產(chǎn)兒的健康與生命，闡明其發(fā)病機制對于NEC的早期診斷以及干預(yù)治療均具有重要意義。目前認為遺傳易感性、腸道不成熟、微血流灌注失衡、異常腸道菌群定植、腸黏膜免疫應(yīng)激性增高等都是NEC發(fā)病的危險因素[2]。盡管迄今為止仍不能確定何種因素起主導(dǎo)作用，但腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)與功能破壞使細菌與機體的正常關(guān)系失衡導(dǎo)致NEC發(fā)生這一觀點逐漸被認可[13-15]。近年來NEC與腸道菌群的關(guān)系逐漸受到重視，已有研究發(fā)現(xiàn)在NEC患兒中變形菌門增加，厚壁菌門、擬桿菌門降低，而且腸道菌群改變發(fā)生于NEC之前[16-18]。已有大量研究證實，擬桿菌門、厚壁菌門可以調(diào)節(jié)腸道免疫和炎癥，在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[19-21]。

巖藻糖基化糖類基團參與了多種病理生理過程，包括細胞黏附、組織發(fā)育、血管生成、惡性腫瘤發(fā)生及腫瘤代謝等[22]。巖藻糖基化在哺乳動物腸道中普遍存在，腸上皮細胞α1,2-巖藻糖基化主要由半乳糖苷2-α-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2(galactoside2-α-L-fucosyltransferase 2，F(xiàn)ut2)合成，特定的菌群如分節(jié)絲狀菌(SFB)[23]和擬桿菌[24]能夠促進腸道的巖藻糖基化。一些共生菌如擬桿菌等可以產(chǎn)生巖藻糖苷酶，將巖藻糖基從上皮細胞表面分離并與其結(jié)合，結(jié)合的L-巖藻糖被一系列巖藻糖降解酶分解代謝，可用于：①作為能量供細菌利用；②內(nèi)化為巖藻糖基化的莢膜多糖(細菌細胞壁組分)；③調(diào)節(jié)巖藻糖操縱子基因的表達；④作為細菌產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs)的底物；此外，上皮細胞巖藻糖基化可以為擬桿菌等含有巖藻糖苷酶的細菌提供定植優(yōu)勢，增加腸道有益菌群的數(shù)量，促進對機會致病菌定植的抗性[8-9]。在病原體誘導(dǎo)的應(yīng)激損傷時，巖藻糖可以通過改變微生物代謝通路和減少細菌毒力因子表達改善宿主健康[25]。本研究中，NEC模型組F-ECs百分比低于對照組，提示在NEC發(fā)生過程中，腸上皮細胞巖藻糖基化水平下降，可能是NEC中菌群改變的潛在影響因素。

黏膜免疫細胞對于上皮細胞巖藻糖基化的誘導(dǎo)至關(guān)重要。天然淋巴細胞是一類新定義的固有免疫細胞家族，在人體黏膜組織中含量豐富，包括細胞毒性天然淋巴細胞(NK細胞)和非細胞毒性天然淋巴細胞(ILC1s、ILC2s、ILC3s)，近年來天然淋巴細胞與腸道疾病的關(guān)系逐漸受到重視[26]。腸道固有層的天然淋巴細胞主要是ILC3s，ILC3s表達轉(zhuǎn)錄因子維A酸受體相關(guān)孤核受體(RORγt)以及標(biāo)志性細胞因子IL-22和IL-17，IL-22是指導(dǎo)上皮細胞功能的細胞因子，在腸道固有免疫、組織修復(fù)和抗細菌感染中發(fā)揮重要作用[27]。ILC3s的活性受腸道菌群影響，參與糖類代謝和糖酵解過程[28]。Goto等[10]及Pickard等[25]發(fā)現(xiàn)腸道共生菌可以促進ILC3s產(chǎn)生其標(biāo)志性細胞因子IL-22，IL-22可通過IL-22R-STAT3通路誘導(dǎo)上皮細胞Fut2的表達，從而促使腸上皮細胞表面蛋白的巖藻糖基化，對于宿主抵抗病原菌感染十分重要。為了進一步探索NEC巖藻糖基化水平下降的可能機制，本研究采用流式細胞技術(shù)測定了NEC模型組和對照組腸道固有層內(nèi)ILC3s的比例，同時檢測了固有層淋巴細胞IL-22和腸上皮細胞IL-22R、Fut2 mRNA的表達水平，以及固有層淋巴細胞IL-22蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，NEC模型組腸道固有層ILC3s百分比明顯低于對照組，其下游因子IL-22、IL-22R和Fut2表達都明顯降低，提示NEC模型的巖藻糖基化水平降低可能是通過ILC3s-IL-22-Fut2軸調(diào)節(jié)的。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，腸上皮細胞巖藻糖基化水平降低參與了NEC小鼠模型的發(fā)病，可能是通過ILC3s-IL-22-Fut2軸調(diào)節(jié)實現(xiàn)的。目前，NEC的發(fā)生與腸道菌群的研究多停留在相關(guān)性分析方面，闡明其因果關(guān)系成為亟待解決的問題。分析NEC腸道上皮細胞巖藻糖基化的改變，有助于為闡明腸道菌群與NEC發(fā)生的因果關(guān)系提供新的思路，但腸道菌群、免疫細胞與腸上皮細胞巖藻糖基化之間的復(fù)雜互作關(guān)系仍需進一步探索研究。