五種革蘭陰性菌血流感染小鼠血清多肽譜的研究

麻雅婷，張可昕，楊明，陳琛，何賞，王成彬

血流感染是目前臨床上常見(jiàn)的感染性疾病之一，主要包括敗血癥和菌血癥。細(xì)菌性血流感染如果不能及時(shí)診治，可通過(guò)血液系統(tǒng)進(jìn)行播散，隨之發(fā)展為系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，甚至膿毒癥，呈現(xiàn)一種廣泛且不受控制的炎癥反應(yīng)，這是造成高病死率的主要原因[1-2]。近年來(lái)，由于抗生素、激素及免疫抑制劑的廣泛使用，創(chuàng)傷性診療技術(shù)的開(kāi)展，血流感染的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，給醫(yī)護(hù)人員及患者帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)[3]。對(duì)于血流感染的診斷，血培養(yǎng)仍然是目前公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，但所需時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性率低，限制了其在早期診斷方面的應(yīng)用，臨床亟需快速、準(zhǔn)確的血流感染診斷技術(shù)。根據(jù)近幾年各醫(yī)院統(tǒng)計(jì)的血培養(yǎng)病原菌分布情況來(lái)看，革蘭陰性菌仍占主要地位，常見(jiàn)的臨床分離排名前5位的革蘭陰性菌分別為大腸埃希菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和變形桿菌(Proteus)[1,4-8]。本研究建立了上述5種細(xì)菌的血流感染小鼠模型，并應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)聯(lián)合磁珠提取多肽技術(shù)分析這5種革蘭陰性菌血流感染血清多肽圖譜的變化趨勢(shì)，以期為后續(xù)尋找診斷標(biāo)志物并建立相關(guān)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)ICR小鼠，體重25～27g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。小鼠飼養(yǎng)在ABSL2級(jí)動(dòng)物室，在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2 菌株來(lái)源 大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC1144、鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC747、銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853和變形不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29245均由解放軍總醫(yī)院微生物科惠贈(zèng)。

1.3 儀器和試劑 MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀、弱陽(yáng)離子交換磁珠及α-氰基-4羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)均購(gòu)自北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司；BioexplorerTM軟件由北京Bioyong科技公司提供。三氟乙酸(TFA)、分析級(jí)乙腈購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli Q純水器制備的去離子水。

1.4 菌液的配制 對(duì)獲取的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行平板分純及LB液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)12h后，取100μl菌液于LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)增菌培養(yǎng)4～6h。大腸埃希菌的LD50濃度參考謝尹晶[9]實(shí)驗(yàn)所得。其余菌株在進(jìn)行液體培養(yǎng)基增菌后，將重懸的菌液配成4.0麥?zhǔn)蠞岫龋侗认♂尀?個(gè)梯度濃度，經(jīng)小鼠尾靜脈注射，每個(gè)濃度梯度注射5只小鼠，注射量為0.1ml/10g。連續(xù)觀察7d，每日觀察記錄小鼠精神狀態(tài)和死亡情況。采用Karber法計(jì)算各個(gè)細(xì)菌的LD50。通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)所得，肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和變形不動(dòng)桿菌的LD50分別為1.1×109、9.6×108、1.5×108、8.1×108cfu/ml，在建立細(xì)菌性血流感染模型時(shí)均以1/2 LD50濃度菌液感染小鼠。

1.5 動(dòng)物模型的建立及分組 小鼠隨機(jī)分為大腸埃希菌感染組、肺炎克雷伯菌感染組、鮑曼不動(dòng)桿菌感染組、銅綠假單胞菌感染組、變形不動(dòng)桿菌感染組和正常對(duì)照組。各感染組分別注射相應(yīng)菌液，正常對(duì)照組注射無(wú)菌PBS，注射量均為0.1ml/10g。分別于感染后1、3、6、12、24、48、96、168h眼球取血，5000r/min離心20min，分裝其血清，–80℃儲(chǔ)存。各組每個(gè)時(shí)間段10只小鼠。

1.6 血清多肽的提取 具體操作步驟參考多肽提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。①渦旋混勻WCX 磁珠，將10μl磁珠、95μl磁珠結(jié)合緩沖液、10μl血清樣品混勻于0.2ml的PCR管中，室溫靜置5min后置于磁珠分離器內(nèi)，靜置1min；②小心移去上清，加入100μl磁珠清洗緩沖液，充分混勻后將PCR 管置于磁珠分離器內(nèi)，靜置1min，小心移去上清；③重復(fù)步驟“②”2次；④給移去上清含磁珠的管中加入10μl磁珠洗脫緩沖液，混勻后靜置1min，將管置于磁珠分離器內(nèi)，靜置1min，使磁珠吸附至管壁，吸出含有多肽的洗脫液并轉(zhuǎn)移至新的0.2ml PCR管中，–20℃儲(chǔ)存。

1.7 MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)處理 ①將1μl洗脫液點(diǎn)在ClinTOF-2靶板上，室溫干燥后將1μl基質(zhì)(0.8% HCCA)覆蓋樣品上，室溫干燥；②將靶板放入MALDI-TOF質(zhì)譜儀，設(shè)置激光頻率為20Hz，能量為75mv；③用標(biāo)準(zhǔn)品校正儀器后，檢測(cè)樣品，獲得由不同質(zhì)荷比(mass charge ratio，m/z)的多肽峰構(gòu)成的質(zhì)譜圖。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得多肽指紋圖譜采用BioexplorerTM軟件進(jìn)行分析，并均經(jīng)歸一化、基線校正和平滑處理。RB算法用以建立區(qū)分各感染組和正常對(duì)照組。采用秩和檢驗(yàn)比較兩組峰值強(qiáng)度，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠感染后癥狀 小鼠在分別感染5種細(xì)菌6～12h后均出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)減少等；感染后小鼠體重減輕，證明小鼠細(xì)菌血流感染模型基本成功。

2.2 血清多肽質(zhì)譜圖的檢測(cè)及對(duì)其差異多肽的分析 采用BioExplorer軟件分析各組血清多肽質(zhì)譜圖，得到的峰列表和差異峰的數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。5種革蘭陰性菌感染小鼠后，采用MALDI-TOF MS分析每種細(xì)菌的差異多肽峰，結(jié)果顯示，在這5種細(xì)菌感染組中共同出現(xiàn)的多肽峰有33個(gè)。表達(dá)趨勢(shì)為感染組高于正常對(duì)照組的多肽峰有4個(gè)，m/z分別為1001.7、1021.7、1230.2和1270.1；表達(dá)趨勢(shì)為感染組低于正常對(duì)照組的多肽峰有9個(gè)，m/z分別為1513.8、1533.3、2951.3、3113.3、3497.3、5007.3、7506.1、7516.2和7816.7(圖1)；其余多肽峰的變化趨勢(shì)不穩(wěn)定。

表1 5種革蘭陰性菌血流感染小鼠血清多肽指紋圖譜差異峰比較(個(gè))Tab.1 Difference peaks in serum polypeptide fingerprints of mice with bacterial bloodstream infection (n)

圖1 5種革蘭陰性菌血流感染小鼠血清多肽指紋圖譜的共有多肽峰Fig.1 Common peaks in serum polypeptide fingerprints of mice with bacterial bloodstream infection

2.3 細(xì)菌血流感染模型的建立 根據(jù)分析軟件內(nèi)嵌的統(tǒng)計(jì)算法，發(fā)現(xiàn)KNN模型具有較高的分類(lèi)效率，通過(guò)組合m/z7506.1、7516.2、7816.7、2951.3、5007.3這5個(gè)峰建立細(xì)菌血流感染診斷多肽指紋圖譜模型。該模型在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和變形桿菌血流感染診斷中的正確率分別為90.0%、86.7%、83.0%、85.0%和82.7%。

3 討 論

近年來(lái)，醫(yī)院分離得到的常見(jiàn)血培養(yǎng)細(xì)菌以革蘭陰性菌為主要部分，占50.0%～56.1%[1-3,8,10]；其中，大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和變形桿菌是臨床血培養(yǎng)最常見(jiàn)的5種革蘭陰性菌。由于現(xiàn)階段激素的廣泛使用、內(nèi)置靜脈導(dǎo)管的不合理處置，以及廣譜抗生素的濫用，血流感染的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，給患者的診治及合理用藥帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)及高額花費(fèi)[8,11-12]。臨床上對(duì)于血流感染的診斷主要依靠血培養(yǎng)，但其靈敏度受多方面因素的影響，如患者的身體狀況、抽血的時(shí)間及部位、血培養(yǎng)的類(lèi)型及次數(shù)等，且耗時(shí)較長(zhǎng)，假陽(yáng)性率高，限制了該方法在早期診斷血流感染方面的效用。臨床現(xiàn)階段常用C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、白介素6等指標(biāo)來(lái)輔助診斷，但其特異性低，在許多非感染的炎癥反應(yīng)疾病中也有升高，使得輔助早期診斷血流感染的價(jià)值受到了限制。質(zhì)譜是一種快速、敏感和高效的技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤、免疫性疾病及微生物菌種的鑒定等方面[13-16]，對(duì)于細(xì)菌性血流感染的血清學(xué)研究剛剛起步。筆者在前期相關(guān)研究[17]的基礎(chǔ)上，通過(guò)建立5種單細(xì)菌性血流感染模型，分析其差異多肽指紋圖譜，以此來(lái)輔助診斷血流感染。

通過(guò)分析比較5個(gè)細(xì)菌感染組和正常對(duì)照組的多肽指紋圖譜，共發(fā)現(xiàn)有33個(gè)共同出現(xiàn)的峰。提示在革蘭陰性菌造成的血流感染反應(yīng)過(guò)程中，共同激發(fā)了相似的免疫反應(yīng)。革蘭陰性菌致病物質(zhì)主要為內(nèi)毒素，為其細(xì)胞壁外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，由特異性的O抗原、非特異性的核心多糖和脂質(zhì)A三部分組成[4-5]。在細(xì)菌存活時(shí)，LPS僅為細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組成成分，通常不表現(xiàn)毒性作用；當(dāng)細(xì)菌死亡裂解后，LPS游離出來(lái)，發(fā)揮毒性反應(yīng)。其致病機(jī)制可能為L(zhǎng)PS通過(guò)脂質(zhì)A與血液中的LPS結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)結(jié)合后，再與單核-巨噬細(xì)胞表面的受體CD14分子結(jié)合，形成LPS-LBP-CD14復(fù)合物，并與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)及輔助受體髓樣分化因子2相互作用，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和釋放腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子，繼而刺激免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和黏膜上皮細(xì)胞等，產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子、生物活性介質(zhì)、急性期蛋白等，引起多種組織器官或全身性的病理生理反應(yīng)，常見(jiàn)癥狀包括發(fā)熱、寒顫、精神萎靡等[18-19]。MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在這些革蘭陰性菌引起的血流感染血清中有共同的多肽峰出現(xiàn)，從而印證了革蘭陰性菌所造成的免疫反應(yīng)。一些常見(jiàn)的炎癥因子被發(fā)現(xiàn)，血清中紛繁復(fù)雜的物質(zhì)中，一些小分子的多肽在今后輔助診斷血流感染方面仍然有巨大的價(jià)值。

除了5種細(xì)菌感染后血清中檢測(cè)到的共有特征峰外，每種細(xì)菌感染都有各自獨(dú)有的特征峰出現(xiàn)并表現(xiàn)出一定的趨勢(shì)。大腸埃希菌引起的血流感染血清多肽峰的變化趨勢(shì)，我們之前的研究已有闡述[17]。在肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和變形桿菌引起的血流感染中，同樣發(fā)現(xiàn)一些多肽峰隨著感染時(shí)間的不斷延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，分別為肺炎克雷伯菌感染中的m/z 1020.7、1203.9、1842.3；鮑曼不動(dòng)桿菌感染中的m/z 1375.8、1436.3、1277.4；銅綠假單胞菌感染中的m/z 1152.5、1325.7；變形桿菌感染中的m/z 6978.9、6987.4。這些多肽峰的出現(xiàn)，提示機(jī)體為了應(yīng)對(duì)感染可能產(chǎn)生一系列新的物質(zhì)，其有望成為新的輔助診斷血流感染的標(biāo)志物。還有一些多肽峰是隨著感染時(shí)間的不斷延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，分別為肺炎克雷伯菌感染中的m/z 1003.7、1916.9、3398.2；鮑曼不動(dòng)桿菌感染中的m/z 1001.7、1172.8、6985.1；銅綠假單胞菌感染中的m/z 1047.6、1807.8、4083.3；變形桿菌感染中的m/z 1104.1、1151.3、1281.7、1322.5、1366.9，這些多肽峰在感染的早期呈現(xiàn)一個(gè)高水平的狀態(tài)，隨著感染的不斷進(jìn)行，機(jī)體抗感染反應(yīng)出現(xiàn)，使得這些高水平狀態(tài)的物質(zhì)含量不斷下降，預(yù)示著這些多肽峰所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)有可能成為早期升高的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白來(lái)輔助診斷血流感染。

MALDI-TOF MS技術(shù)作為蛋白組學(xué)研究的新技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、腎病等疾病[20-22]新型標(biāo)志物的尋找中。在微生物研究方面主要應(yīng)用于細(xì)菌、真菌等的鑒定中。由于微生物中應(yīng)用質(zhì)譜鑒定還需經(jīng)過(guò)培養(yǎng)等環(huán)節(jié)，通過(guò)挑取單個(gè)菌落進(jìn)行質(zhì)譜分析，根據(jù)已有的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)得出菌種鑒定的結(jié)果，這其中就很大程度上依賴(lài)于數(shù)據(jù)庫(kù)的更新及操作的規(guī)范程度，由于很多菌種基因結(jié)構(gòu)背景相近，質(zhì)譜圖很難區(qū)分，所以給臨床微生物血流感染的診斷帶來(lái)了一定的不便[23-24]。目前，對(duì)于血流感染血清學(xué)多肽方面的研究還尚未見(jiàn)大量報(bào)道，而收集臨床血流感染標(biāo)本時(shí)患者基礎(chǔ)疾病復(fù)雜，難以控制單一變量，故本研究通過(guò)建立ICR血流感染小鼠模型研究其血清學(xué)多肽的變化來(lái)尋找具有潛在臨床價(jià)值的生物標(biāo)志物，用于輔助診斷血流感染，為臨床血流感染的防治提供良好的依據(jù)。

本研究重點(diǎn)分析了5種常見(jiàn)革蘭陰性菌血流感染的血清多肽指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)了其共有的特征峰及每種細(xì)菌感染后的特征峰，由此建立相應(yīng)的診斷模型，有望輔助早期診斷血流感染。今后我們還將建立常見(jiàn)革蘭陽(yáng)性菌、真菌性血流感染等模型，分析革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌及真菌之間的血清差異多肽指紋圖譜，同時(shí)對(duì)尋找到的差異多肽峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜多肽鑒定，以期為血流感染新型標(biāo)志物的尋找奠定基礎(chǔ)。