紫草乳膏提取工藝研究

曾祖平 石 佳 王子君 王 宏

(1 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所，北京，100010； 2 首都醫(yī)科大學，北京，100013； 3 湖北中醫(yī)藥大學，武漢，430065)

紫草膏收載于《趙炳南臨床經(jīng)驗集》，源自明代薛己《外科方》，由當歸四兩、紫草四兩、白芷二兩、紅花二兩組成，用香油二斤半和黃蠟八兩煉膏去渣制成[1]。方中紫草為君，涼血活血解毒；當歸為臣，活血補血；紅花活血化斑，涼血解毒，白芷散風消腫止癢，共為佐使，全方共奏涼血活血、解毒消腫之效，主治銀屑病、丹毒等。紫草膏屬油膏劑，藥物經(jīng)高溫油炸，雖能得到一些脂溶性成分，但不利于某些熱不穩(wěn)定性成分及水溶性成分的提取[2-3]。本研究根據(jù)藥物中藥效成分的理化性質(zhì)進行適當提取，制定合理的提取工藝，為后續(xù)的乳膏劑成型工藝和質(zhì)量控制奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；DU-800分光光度計(BECKMAN COULTER)；FW135型傾斜式高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；SK7210HP超聲波清洗機(上?？茖С晝x器有限公司)；XS205超越系列專業(yè)型分析天平(METTLER TOLEDO)；PB203-N電子精密天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；Milli-Q純水儀(MILLIPORE)。

1.2 試藥 紫草膏處方飲片(北京杏林藥業(yè)有限責任公司)；左旋紫草素(批號769-9803，中國食品藥品檢定研究院)；羥基紅花黃素A(批號：11637-200905，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為純水儀制備，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫草、白芷提取工藝研究

2.1.1 提取工藝路線設計 根據(jù)紫草、白芷中的藥效成分的理化性質(zhì)，采用乙醇作為提取溶劑。根據(jù)預實驗結(jié)果，采用滲漉法提取紫草、白芷。

2.1.2 正交實驗 根據(jù)滲漉法的操作要點，確定考察因素為藥材粒度、浸漬時間、溶劑用量；根據(jù)預實驗結(jié)果，設計L9(34)正交試驗，以羥基萘醌總色素的轉(zhuǎn)移率作為評價指標優(yōu)化滲漉工藝參數(shù)，因素水平安排見表1。

表1 滲漉工藝因素水平

按表1設定的試驗條件，分別稱取相應粒度的紫草粉10 g和白芷粉5 g，混合均勻，裝入筒形分液漏斗，加藥粉總量4倍的95%乙醇浸漬相應時間，開始滲漉，并添加相應量溶劑，分別收集漉液于250 mL量瓶中，95%乙醇定容至刻度，搖勻。精密吸取定容液0.5 mL于10 mL量瓶中稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.1.3 線性關系考察 精密稱取左旋紫草素(五氧化二磷減壓干燥22 h)0.0080 g于100 mL量瓶中，用甲醇超聲溶解后定容至刻度，得到0.08 mg/mL的左旋紫草素儲備液。精密量取左旋紫草素儲備液各0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL于5個10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，于516 nm測定吸光度，以吸光度為縱坐標，以濃度為橫坐標，建立回歸方程y=23.141x+0.008(r2=0.998)，線性范圍為0.004～0.032 mg/mL。

2.1.4 專屬性考察 取白芷最粗粉5 g，按2.1.2項下1號實驗條件制備紫草陰性對照液，進行掃描，結(jié)果516 nm無明顯吸收，表明白芷對紫草中羥基萘醌總色素的測定無干擾。

2.1.5 穩(wěn)定性考察 供試液在0～5 h之內(nèi)，每隔30 min于516 nm測定吸收度，結(jié)果RSD=2.02%，說明供試液5 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.6 精密度考察 同一供試液樣品連續(xù)測定吸收度6次，結(jié)果RSD=0.53%，說明儀器精密度良好。

2.1.7 重復性考察 1號滲漉液按2.1.2項下方法制備供試液，平行操作6份，于516 nm測定吸收度，結(jié)果RSD=1.04%，表明方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 于已知含量的1號滲漉液中精密加入一定量的左旋紫草素儲備液，平行操作6份，依法測定，結(jié)果平均回收率為98.66%，RSD=1.23%(n=6)，符合要求。

2.1.9 樣品測定 正交實驗得到的1號-9號供試液于516 nm下測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算羥基萘醌總色素含量；根據(jù)藥材的含量計算轉(zhuǎn)移率。見表2。

表2 滲漉工藝正交試驗結(jié)果

2.1.10 數(shù)據(jù)分析 對正交實驗結(jié)果進行直觀分析，可見影響轉(zhuǎn)移率的因素依次為A(藥材粒度)、B(提取時間)、C(乙醇用量)，最佳提取工藝是A1B3C3，即藥材粗粉、10倍量溶劑、浸漬48 h。采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，顯示因素A即藥材粒度對轉(zhuǎn)移率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 滲漉工藝正交實驗方差分析結(jié)果

2.1.11 紫草白芷滲漉工藝驗證試驗 取紫草粗粉10 g和白芷粗粉5 g，共3份，混合均勻，分別裝入滲漉筒中，加95%乙醇60 mL，浸漬48 h，開始滲漉，并添加95%乙醇150 mL，收集漉液于250 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻。精密吸取定容液0.5 mL于10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻。分別于516 nm下測定吸光度，結(jié)果羥基萘醌總色素的轉(zhuǎn)移率平均為98.89%(RSD=1.00%)，表明優(yōu)選出的條件具有重現(xiàn)性。

2.2 紅花、當歸提取工藝

2.2.1 提取工藝路線設計 根據(jù)紫草膏的功效，結(jié)合藥效學研究結(jié)果及藥效成分理化性質(zhì)設計提取工藝路線。以水為溶媒，紅花、當歸飲片浸泡30 min后提取2次[4-5]。正交試驗的考察因素設計了溶劑用量(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)三因素，以提取液中羥基紅花黃素A含量為考察指標，設計L9(34)因素水平見表5。

表5 水提工藝因素水平

2.2.2 正交試驗 紅花2 g/份、當歸4 g/份，共9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按照表5中正交試驗安排進行試驗，加入第一次溶劑后浸泡0.5 h后提取。每次提取液放冷，濾過，合并2次濾液，轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，純凈水定容，搖勻。

2.2.3 HPLC色譜條件 Kromasil 100-5C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)色譜柱，甲醇-乙腈-0.7%磷酸水溶液(26∶2∶72)作為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為403 nm；柱溫為室溫，理論塔板數(shù)羥基紅花黃素A應不低于3 000[6]。

2.2.4 對照品溶液制備 精密稱取紅花黃素A0.0098 g于50 mL量瓶中，純凈水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 供試品溶液制備 分別精密量取上述9個正交實驗樣品溶液0.5 mL于25 mL容量瓶中，純凈水定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.6 線性關系考察 分別精密量取對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL量瓶中，用純凈水稀釋并定容至刻度，搖勻，濾過，按上述色譜條件進樣各5 μL，測定，以峰面積為縱坐標，以羥基紅花黃素A質(zhì)量為橫坐標，建立回歸方程y=3 314.8x-39.257(r2=0.999 7)，線性范圍為0.098～0.98 μg。

2.2.7 精密度試驗 同一供試液連續(xù)6次進樣，羥基紅花黃素A峰面積RSD為1.01%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 同一份正交試驗提取液，按(3)項下方法制備供試品溶液，共6份，按(1)項下色譜條件進樣5 μL，測定，結(jié)果羥基紅花黃素A含量的RSD=1.43%，表明方法重復性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試液，每隔1 h進樣測定1次，連續(xù)測定6 h，結(jié)果羥基紅花黃素A峰面積RSD=1.52%(n=7)，表明供試液中羥基紅花黃素A在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 回收率試驗 精密吸取已知含量的正交試驗3號提取液0.3 mL，共6份，置25 mL量瓶中，分別精密加入羥基紅花黃素A對照品溶液各0.1 mL，純凈水定容，搖勻，濾過，進樣5 μL測定，計算回收率，結(jié)果平均回收率為99.64%(RSD=1.49%)。

2.2.11 供試液測定 9份供試品溶液按2.2.3項下色譜條件分別進樣5 μL，測定。見表6。色譜圖見圖1。

表6 水提工藝正交試驗結(jié)果

圖1 HPLC圖譜

注：A.對照品溶液；B.供試品溶液；1.羥基紅花黃素A

2.2.4 數(shù)據(jù)處理及分析 影響提取因素的順序：B>C>A；最佳提取條件為A1B3C3，即：飲片浸泡30 min后，70 ℃溫浸2次，60 min/次，第1次用14倍溶劑量，第2次用12倍溶劑量。方差分析顯示，因素B對提取影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表7。

2.2.5 驗證實驗 直觀分析和方差分析顯示，因素A對提取工藝影響最小，考慮到后續(xù)操作的方便，同時驗證A1B3C3和A2B3C3。取紅花2 g/份，當歸4 g/份，共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按A1B3C3和A2B3C3條件各操作3份，按2.2.3制備供試品溶液并測定。結(jié)果兩工藝提取的羥基紅花黃素A含量分別為1.51%(RSD=1.86%)和1.49%(RSD=1.76%)，表明工藝具有重現(xiàn)性，兩工藝得到的羥基紅花黃素A含量差異無統(tǒng)計學意義。考慮到A2B3C3在后續(xù)濃縮過程中可減少濃縮時間，減少有效成分損失的可能，故確定提取條件為A2B3C3，即飲片浸泡30 min后，70 ℃溫浸2次，60 min/次，第1次溶劑用量為藥材質(zhì)量的12倍，第2次為10倍。

表7 水提工藝正交實驗方差分析結(jié)果

3 討論

紫草中主要藥效成分為蒽醌類色素，脂溶性強，易溶于石油醚等有機溶劑，可溶于乙醇[7]；參考考慮到生產(chǎn)實際情況，采用95%乙醇提取[8-9]。白芷中治療銀屑病的有效成分歐前胡素、異歐前胡素也具有脂溶性，溶于乙醇，與紫草一起采用95%乙醇提取[10]。

紫草中主要藥效成分為羥基萘醌衍生物，具有脂溶性和熱不穩(wěn)定性，高于60 ℃可使成分大部分破壞，因此提取溫度為提取關鍵條件，提取方法選擇時考察了滲漉法和溫浸法，以95%乙醇為提取溶劑，比較兩者對藥效成分的保留程度。結(jié)果滲漉法提取的羥基萘醌總色素含量高于溫浸法，因此采用滲漉法提取紫草、白芷。

紅花具有擴張血管，增加血流量及改善微循環(huán)、抗凝血及抑制血小板聚集、鎮(zhèn)痛及抗炎作用，這些作用與紫草膏的功效吻合；紅花的有效成分主要集中于水溶性的紅花黃色素。當歸水煎液對多種致炎劑引起的急性毛細管通透性增加、組織水腫及慢性炎性反應損傷均有顯著抑制作用，且能抑制炎性反應后期肉芽組織增生；對豚鼠Forssman皮膚血管炎及大鼠反向皮膚過敏反應具有顯著的抑制作用，且能明顯抑制大鼠波動Arthus反應，提示當歸對Ⅱ、Ⅲ型變態(tài)反應炎性反應也有抑制作用[11-15]。因此，以水作為紅花、當歸的提取溶劑。

紅花、當歸藥材的主要藥效成分羥基紅花黃色素A、阿魏酸對熱不穩(wěn)定，較長時間的加熱會造成有效成分分解，從而降低藥效[16]。因此正交試驗中考察了提取溫度。預試驗結(jié)果表明，提取時溫度應控制在70 ℃以下。故不用加熱回流法提取，而采用水浴溫浸法。

白芷作為佐使藥，試驗中采用薄層色譜法控制其質(zhì)量。實驗結(jié)果顯示，紫外燈(365 nm)下，驗證實驗得到的滲漉液中，在與白芷對照藥材和歐前胡素對照品色譜相應的位置顯相同顏色的熒光斑點。說明紫草白芷滲漉液中含有歐前胡素等白芷中的多種成分，提取方法合理可行。

紅花當歸的提取正交實驗中，對當歸中含有的阿魏酸也進行了HPLC測定。9個試驗中阿魏酸含量在0.027%～0.064%之間，極差分析和方差分析得到的結(jié)論與羥基紅花黃色素A的結(jié)論一致。