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    前列寧膠囊調(diào)控MMP-2影響細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)良性前列腺增生治療的影響

    2018-11-29 02:11:54周建衡林久茂洪振豐
    世界中醫(yī)藥 2018年11期
    關(guān)鍵詞:貨號(hào)胞外基質(zhì)列寧

    周建衡 楊 弘 林久茂 洪振豐

    (1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福州,350122; 2 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福州,350122)

    老年男性中,良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)是最常見的泌尿系統(tǒng)疾病之一[1],BPH發(fā)病機(jī)制與眾多因素有關(guān),目前,間質(zhì)-上皮的相互作用在BPH發(fā)病中地位已得到醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)可[2-3],其中細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)在間質(zhì)-上皮相互作用中起著關(guān)鍵作用[4-6],課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)前列寧膠囊(QC)對(duì)BPH具有顯著治療效果[7-8],為進(jìn)一步研究QC對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)影響,探討QC治療BPH的機(jī)制,開展本研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物 健康SPF級(jí)成年雄性SD大鼠50只,體重190~220 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,許可證號(hào):SCXK(滬2007-0005),批號(hào):0017446。正常喂養(yǎng),置實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.1.2 BPH-1細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)用BPH-1細(xì)胞株,由南開大學(xué)生命科學(xué)院分子生物研究所購買所得。

    1.1.3 藥物 丙酸睪酮注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司,生產(chǎn)批號(hào):H31020524);前列寧膠囊由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院研制,批號(hào):閩Z20110009。動(dòng)物用藥濃度低劑量組2.25 g/kg·d(相當(dāng)于臨床用藥量的3倍)、前列寧膠囊高劑量組9 g/kg·d(相當(dāng)于臨床用藥量的12倍);細(xì)胞用藥用DMSO溶解,配制成最終濃度為0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL。

    1.1.4 試劑與儀器 MMP-2刺激因子:美國Sigma-Aldrich公司(貨號(hào):1208473-2);MTT:北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào):M8180);Trizol:大連TaKaRa公司(貨號(hào):9109);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:大連Takara生物有限公司(貨號(hào):RR047A);BCA蛋白定量分析試劑盒:美國Thermo Fisher Scientific公司(貨號(hào):MK164229)β-actin抗體:美國Cell Signaling Technology公司(貨號(hào):#4970)MMP-2抗體:美國Abcam公司(貨號(hào):ab37150)LN抗體:美國Abcam公司(貨號(hào):ab11575)Collagen IV抗體:美國Abcam公司(貨號(hào):ab6586)FN抗體:美國Antibody Revolution(貨號(hào):#3G4);Horeseradish peroxidase(HRP)二抗:Cell Signaling Technology公司(貨號(hào):7074);引物:南京金斯瑞生物科技有限公司合成;一抗稀釋液:中國beyotime生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):P0023A);Western封閉液:中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):P0023B);Western二抗稀釋液:100 mL,中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):P0023D)。二氧化碳培養(yǎng)箱:美國Thermo Fisher Scientific公司;倒置顯微鏡系統(tǒng):徠卡儀器公司;Elx800酶標(biāo)儀:美國BioTek公司;PCR儀:美國BIO-RAD公司;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDocXRS+:美國BIO-RAD公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)儀:美國CountStar公司。

    1.2 方法

    1.2.1 分組與物模型的制備 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只,氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉,經(jīng)陰囊行無菌手術(shù),摘除雙側(cè)睪丸,恢復(fù)1周后,每只皮下注射丙酸睪酮5 mg/kg·d,連續(xù)28 d,每周稱體重1次[9]。

    1.2.2 給藥方法 成功手術(shù)摘除雙側(cè)睪丸后,繼續(xù)丙酸睪酮注射造模的同時(shí),除空白對(duì)照組和病理模型組大鼠灌服生理鹽水外,其余各組按照相應(yīng)劑量給藥。給藥劑量分別為:空白組、病理模型組生理鹽水10 mL/kg·d、前列寧膠囊低劑量組2.25 g/kg·d(相當(dāng)于臨床用藥量的3倍)、前列寧膠囊高劑量組9 g/kg·d(相當(dāng)于臨床用藥量的12倍),以上均采用灌胃給藥1次/d,連續(xù)28 d(給藥期間,每周稱體重一次以調(diào)整給藥劑量)。末次灌胃后禁食24 h,各鼠稱重(g),麻醉,腹主動(dòng)脈取血(檢測(cè)其他指標(biāo)),分離出完整的前列腺組織,并小心將其完整地取出,待測(cè)相關(guān)指標(biāo);取相同部位的前列腺組織各一塊,用10%福爾馬林固定液固定待測(cè);取50~100 mg前列腺組織保存于液氮中,待測(cè)其他指標(biāo)。

    1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

    1.2.3.1 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中MMP-2、FN、Collagen IV、LN含量 上海西唐生物科技有限公司提供所用試劑盒均,按操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.2.3.2 BPH-1細(xì)胞培養(yǎng)及MMP-2因子刺激 將BPH-1細(xì)胞株置RPMI-1640培養(yǎng)液中(含10%熱滅活胎牛血清),培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入MMP-2,根據(jù)說明書將MMP-2因子粉末用1 mLPBS稀釋成10 μg/mL的溶液并于-20 ℃保存,當(dāng)12孔板以及培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞密度達(dá)到50%~60%時(shí),按照每1 mL培養(yǎng)基加入1 μL濃度為10 μg/mL的MMP-2因子進(jìn)行刺激,培養(yǎng)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長的BPH-1細(xì)胞,0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞,用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞密度調(diào)整為0.8×105個(gè)/mL,接種于96孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞分為2組(未加MMP-2組)加入(MMP-2組),每組QC給藥濃度分別為0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL 4個(gè)劑量組,以上各組均設(shè)8個(gè)復(fù)孔,每孔100 μL,常規(guī)培養(yǎng)24 h,細(xì)胞同步化。培養(yǎng)24 h及48 h,吸棄各孔中的液體,各孔分別加入MTT溶液,37 ℃孵育4 h,再吸棄各孔中的液體,加入DMSO,振蕩混勻,室溫放置10 min,溶解并混勻,全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定各組吸光度值(即A值),并按公式計(jì)算細(xì)胞活率:細(xì)胞活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組A值/對(duì)照組A值)×100%。

    1.2.3.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 不同濃度的QC干預(yù)BPH-1細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照。

    1.2.3.5 Q-PCR法檢測(cè)FN、LN、Collagen IV、MMP-2的基因表達(dá) RNA提取及其逆轉(zhuǎn)錄:對(duì)數(shù)生長期的人BPH-1細(xì)胞接種于12孔板,密度為1.5×105個(gè)/孔,在37 ℃,5%CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后,分別以不同濃度的QC(0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL)以及MMP-2和QC共同作用,24 h后,Trizol法用于提取總RNA,具體操作根據(jù)說明書操作步驟,最后用適量DEPC水溶解后進(jìn)行濃度檢測(cè),RNA濃度測(cè)定:采用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),按說明書配制反應(yīng)體系及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Q-PCR檢測(cè)目的基因表達(dá):PCR反應(yīng)體系(20 μl體系):cDNA 1 μL,PCR MIX(2x)10 μL,上下游引物各0.4 μL,加DEPC水至20 μL,反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃,30 s,變性95 ℃,3 s,退火30 s,60 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì):使用NCBI或文獻(xiàn)查找目的基因全序列,采用Premier5.0設(shè)計(jì)引物,目的基因引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,相關(guān)信息如下:

    表1 MMP2、LN、FN、collagenIV和β-actin基因的特異性引物序列

    1.2.3.6 Western Blot檢測(cè)FN、LN、Collagen IV、MMP-2蛋白表達(dá) 調(diào)整BPH-1細(xì)胞密度按照2.5×l05個(gè)/mL密度接種于體積中為25 cm3中,置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,分別加入不同濃度的QC(0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL)以及MMP-2和QC共同作用24 h后。離心去除上清液,使用PBS漂洗、RIPA裂解液抽提蛋白,細(xì)胞蛋白樣品定量,變性;電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂、封閉,洗膜,加入FN、LN、Collagen IV、MMP-2(稀釋倍數(shù)1∶1 000)的一抗以及β-actin(稀釋倍數(shù)1∶1 000)作為陽性對(duì)照,4 ℃震蕩過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋倍數(shù)1∶5 000)后,室溫孵育1 h,TBS洗膜,加入1∶1的ECL發(fā)光液,在25 ℃溫育5 min,即刻曝光,凝膠成像系統(tǒng)掃描并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 QC對(duì)BPH大鼠血清LN、FN、collagenIV、MMP2的影響 模型組血清MMP2含量與空白組比較明顯降低,LN、FN、collagenIV高于空白組(P<0.05);前列寧膠囊各劑量組中MMP2明顯升高(P<0.05);LN、FN、collagenIV各自中均不同程度下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    2.2 QC對(duì)BPH-1細(xì)胞形態(tài)及活性影響 倒置顯微鏡下觀察,各組BPH-1細(xì)胞呈菱,QC干預(yù)后,隨著QC濃度的增加,可觀察到細(xì)胞形態(tài)完整性逐漸改變,形細(xì)胞均勻度,核仁清晰度下降,細(xì)胞數(shù)逐漸減少,加入MMP-2組中較及未加入MMP-2組更為明顯。見圖1。MTT檢測(cè)顯示QC作用24 h及48 h后未加入MMP-2各組細(xì)胞有不同程度活力下降,以5 mg/mL最為明顯。見圖2A。MTT還顯示,QC作用同時(shí)加入MMP-2,各劑量組BPH-1各劑量組細(xì)胞活力24 h時(shí)活力下降,48 h后下降更明顯(P<0.05或P<0.01)并且與QC成量效關(guān)系。見圖2B。

    2.3 QC作用BPH-1細(xì)胞同時(shí)加入MMP-2后對(duì)FN、LN、CollageIV基因及蛋白表達(dá)影響 QC干預(yù)后,隨著QC濃度的增加細(xì)胞中FN、LN、CollageIV基因及蛋白表達(dá)明顯降低見圖3A、B;QC干預(yù)干預(yù)同時(shí)加入MMP-2因子,FN、LN、CollageIV基因及蛋白表達(dá)也明顯降低并且同未加入MMP-2比較更加明顯降低見圖3C、D。

    表2 QC對(duì)BPH大鼠血清中MMP2、LN、FN、collagenIV的影響

    注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

    圖1 QC作用后及QC作用同時(shí)加入MMP-2后BPH-1細(xì)胞形態(tài)改變(100×)

    圖2 QC作用后及QC作用同時(shí)加入MMP-2后BPH-1細(xì)胞活力變化

    圖3 QC作用后及QC作用同時(shí)加入MMP-2后BPH-1 FN、LN、CollageIV基因及蛋白表達(dá)變化

    圖4 QC作用后對(duì)BPH-1細(xì)胞中MMP-2基因及蛋白表達(dá)影響

    2.4 QC對(duì)BPH-1細(xì)胞中MMP-2基因及蛋白表達(dá)影響 QC干預(yù)后,隨著QC濃度的增加細(xì)胞中MMP-2基因及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),呈現(xiàn)量效關(guān)系見圖4A、B。

    3 討論

    中醫(yī)學(xué)中將良性前列腺增生(BPH)歸屬為“癃閉”“精癃”等范疇,其中醫(yī)病機(jī)及病理、病因目前仍未有合理解釋,研究表明細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)學(xué)說一直是BPH發(fā)病的重要機(jī)制之一,由于ECM給細(xì)胞的生存及活動(dòng)提供適宜的環(huán)境,它可以通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響細(xì)胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化,在維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用[10],ECM也參與調(diào)節(jié)控制細(xì)胞的多種生理和病理過程[11-12],ECM在BPH發(fā)病過程中發(fā)揮的作用是多方面的,例如,前列腺中增殖的細(xì)胞與ECM共同作用導(dǎo)致前列腺組織形態(tài)及生理功能改變[13-14];ECM還可以與雄-雌激素及各種生長因子相互作用導(dǎo)致BPH,可以調(diào)節(jié)前列腺組織中活性肽類物質(zhì)[15],刺激細(xì)胞產(chǎn)生不同的細(xì)胞外基質(zhì)成分[16],加強(qiáng)前列腺細(xì)胞對(duì)雄激素(DHT)及部分生長因子的敏感性,從而改變成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及增強(qiáng)前列腺細(xì)胞對(duì)性激素的敏感性加強(qiáng)基因表達(dá)[17];各種生長因子如TGF-β,這些生長因子從前列腺細(xì)胞中分泌也可以受ECM影響。但是ECM受多種酶類降解,MMPS被認(rèn)為是最重要的一類。MMP-2屬于MMPS家族中的明膠酶,其分布最為廣泛,可降解Ⅳ型膠原、FN和層黏蛋白(LN)等,MMP-2含量的高低對(duì)降解ECM成分發(fā)揮重要作用[18]。

    前列寧膠囊是本課題組以中醫(yī)理論為指導(dǎo)現(xiàn)已開發(fā)為現(xiàn)福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院院內(nèi)制劑(20090521),課題組前期研究發(fā)現(xiàn)前列寧膠囊(QC)具有抑制BPH細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子作用,對(duì)BPH具有良好治療作用[19-22],同時(shí)能夠調(diào)節(jié)部分ECM成分作用;在本實(shí)驗(yàn)中,課題組查閱文獻(xiàn)采用曾多次已成功復(fù)制BPH模型方法制備BPH動(dòng)物模型[9,19,22],實(shí)驗(yàn)表明模型組大鼠血清中FN、LN、Collagen IV含量明顯高于空白組,MMP-2含量明顯低于空白組,表明模型組與空表組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;QC觀察組中,大鼠血清FN、LN、Collagen IV含量較模型組低,而MMP-2含量明顯高于模型組(P<0.05),表明QC能有效降低BPH血清FN、LN、Collagen IV表達(dá)升高M(jìn)MP-2表達(dá)。離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,QC干預(yù)BPH-1細(xì)胞培養(yǎng),并且加入MMP-2因子,實(shí)驗(yàn)表明QC干預(yù)后細(xì)胞活性在低、中、高劑量組中細(xì)胞活性不同程度下降,加入MMP-2后細(xì)胞活性下降更明顯;Q-PCR及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單純用QC干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng),FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表達(dá)明顯降低,MMP-2基因及蛋白表達(dá)升高;QC干預(yù)同時(shí)加入MMP-2后FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表達(dá)較單純QC干預(yù)降低更加明顯,表明在細(xì)胞培養(yǎng)中QC能夠有效抑制FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表達(dá)并且具有增強(qiáng)MMP-2基因及蛋白表達(dá)作用,同時(shí)也表明MMP-2可以抑制FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表達(dá)作用。

    綜上所述,QC對(duì)BHP具有明顯治療作用,其治療機(jī)制可能是多靶點(diǎn),前期研究發(fā)現(xiàn)QC具有抑制前列腺細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,對(duì)不同細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)等作用[10-14],本研究還表明,QC具有降低動(dòng)物血清中細(xì)胞外基質(zhì)成分FN、LN、Collagen IV含量作用,抑制BPH-1細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)成分FN、LN、Collagen IV表達(dá),調(diào)控MMP-2的作用,表明QC通過介導(dǎo)MMP-2因子調(diào)控ECM成分的表達(dá)抑制前列腺細(xì)胞增殖是QC治療BPH的另一重要機(jī)制。

    總之,本文證實(shí)了QC通過調(diào)控ECM對(duì)BPH治療作用,區(qū)別于前期報(bào)道QC調(diào)控細(xì)胞凋亡及激素水平治療BPH,為首次報(bào)道,具有一定意義,QC是否能調(diào)控調(diào)控miRNA達(dá)到降解ECM治療BPH;在后期研究中可以從相關(guān)微小基因?yàn)榍腥朦c(diǎn),研究前列寧膠囊對(duì)BPH治療作用,進(jìn)一步闡明前列寧治療機(jī)制。

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