• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    前列寧膠囊調(diào)控MMP-2影響細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)良性前列腺增生治療的影響

    2018-11-29 02:11:54周建衡林久茂洪振豐
    世界中醫(yī)藥 2018年11期
    關(guān)鍵詞:貨號(hào)胞外基質(zhì)列寧

    周建衡 楊 弘 林久茂 洪振豐

    (1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福州,350122; 2 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福州,350122)

    老年男性中,良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)是最常見的泌尿系統(tǒng)疾病之一[1],BPH發(fā)病機(jī)制與眾多因素有關(guān),目前,間質(zhì)-上皮的相互作用在BPH發(fā)病中地位已得到醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)可[2-3],其中細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)在間質(zhì)-上皮相互作用中起著關(guān)鍵作用[4-6],課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)前列寧膠囊(QC)對(duì)BPH具有顯著治療效果[7-8],為進(jìn)一步研究QC對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)影響,探討QC治療BPH的機(jī)制,開展本研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物 健康SPF級(jí)成年雄性SD大鼠50只,體重190~220 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,許可證號(hào):SCXK(滬2007-0005),批號(hào):0017446。正常喂養(yǎng),置實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.1.2 BPH-1細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)用BPH-1細(xì)胞株,由南開大學(xué)生命科學(xué)院分子生物研究所購買所得。

    1.1.3 藥物 丙酸睪酮注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司,生產(chǎn)批號(hào):H31020524);前列寧膠囊由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院研制,批號(hào):閩Z20110009。動(dòng)物用藥濃度低劑量組2.25 g/kg·d(相當(dāng)于臨床用藥量的3倍)、前列寧膠囊高劑量組9 g/kg·d(相當(dāng)于臨床用藥量的12倍);細(xì)胞用藥用DMSO溶解,配制成最終濃度為0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL。

    1.1.4 試劑與儀器 MMP-2刺激因子:美國Sigma-Aldrich公司(貨號(hào):1208473-2);MTT:北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào):M8180);Trizol:大連TaKaRa公司(貨號(hào):9109);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:大連Takara生物有限公司(貨號(hào):RR047A);BCA蛋白定量分析試劑盒:美國Thermo Fisher Scientific公司(貨號(hào):MK164229)β-actin抗體:美國Cell Signaling Technology公司(貨號(hào):#4970)MMP-2抗體:美國Abcam公司(貨號(hào):ab37150)LN抗體:美國Abcam公司(貨號(hào):ab11575)Collagen IV抗體:美國Abcam公司(貨號(hào):ab6586)FN抗體:美國Antibody Revolution(貨號(hào):#3G4);Horeseradish peroxidase(HRP)二抗:Cell Signaling Technology公司(貨號(hào):7074);引物:南京金斯瑞生物科技有限公司合成;一抗稀釋液:中國beyotime生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):P0023A);Western封閉液:中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):P0023B);Western二抗稀釋液:100 mL,中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):P0023D)。二氧化碳培養(yǎng)箱:美國Thermo Fisher Scientific公司;倒置顯微鏡系統(tǒng):徠卡儀器公司;Elx800酶標(biāo)儀:美國BioTek公司;PCR儀:美國BIO-RAD公司;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDocXRS+:美國BIO-RAD公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)儀:美國CountStar公司。

    1.2 方法

    1.2.1 分組與物模型的制備 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只,氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉,經(jīng)陰囊行無菌手術(shù),摘除雙側(cè)睪丸,恢復(fù)1周后,每只皮下注射丙酸睪酮5 mg/kg·d,連續(xù)28 d,每周稱體重1次[9]。

    1.2.2 給藥方法 成功手術(shù)摘除雙側(cè)睪丸后,繼續(xù)丙酸睪酮注射造模的同時(shí),除空白對(duì)照組和病理模型組大鼠灌服生理鹽水外,其余各組按照相應(yīng)劑量給藥。給藥劑量分別為:空白組、病理模型組生理鹽水10 mL/kg·d、前列寧膠囊低劑量組2.25 g/kg·d(相當(dāng)于臨床用藥量的3倍)、前列寧膠囊高劑量組9 g/kg·d(相當(dāng)于臨床用藥量的12倍),以上均采用灌胃給藥1次/d,連續(xù)28 d(給藥期間,每周稱體重一次以調(diào)整給藥劑量)。末次灌胃后禁食24 h,各鼠稱重(g),麻醉,腹主動(dòng)脈取血(檢測(cè)其他指標(biāo)),分離出完整的前列腺組織,并小心將其完整地取出,待測(cè)相關(guān)指標(biāo);取相同部位的前列腺組織各一塊,用10%福爾馬林固定液固定待測(cè);取50~100 mg前列腺組織保存于液氮中,待測(cè)其他指標(biāo)。

    1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

    1.2.3.1 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中MMP-2、FN、Collagen IV、LN含量 上海西唐生物科技有限公司提供所用試劑盒均,按操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.2.3.2 BPH-1細(xì)胞培養(yǎng)及MMP-2因子刺激 將BPH-1細(xì)胞株置RPMI-1640培養(yǎng)液中(含10%熱滅活胎牛血清),培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入MMP-2,根據(jù)說明書將MMP-2因子粉末用1 mLPBS稀釋成10 μg/mL的溶液并于-20 ℃保存,當(dāng)12孔板以及培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞密度達(dá)到50%~60%時(shí),按照每1 mL培養(yǎng)基加入1 μL濃度為10 μg/mL的MMP-2因子進(jìn)行刺激,培養(yǎng)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長的BPH-1細(xì)胞,0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞,用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞密度調(diào)整為0.8×105個(gè)/mL,接種于96孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞分為2組(未加MMP-2組)加入(MMP-2組),每組QC給藥濃度分別為0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL 4個(gè)劑量組,以上各組均設(shè)8個(gè)復(fù)孔,每孔100 μL,常規(guī)培養(yǎng)24 h,細(xì)胞同步化。培養(yǎng)24 h及48 h,吸棄各孔中的液體,各孔分別加入MTT溶液,37 ℃孵育4 h,再吸棄各孔中的液體,加入DMSO,振蕩混勻,室溫放置10 min,溶解并混勻,全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定各組吸光度值(即A值),并按公式計(jì)算細(xì)胞活率:細(xì)胞活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組A值/對(duì)照組A值)×100%。

    1.2.3.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 不同濃度的QC干預(yù)BPH-1細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照。

    1.2.3.5 Q-PCR法檢測(cè)FN、LN、Collagen IV、MMP-2的基因表達(dá) RNA提取及其逆轉(zhuǎn)錄:對(duì)數(shù)生長期的人BPH-1細(xì)胞接種于12孔板,密度為1.5×105個(gè)/孔,在37 ℃,5%CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后,分別以不同濃度的QC(0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL)以及MMP-2和QC共同作用,24 h后,Trizol法用于提取總RNA,具體操作根據(jù)說明書操作步驟,最后用適量DEPC水溶解后進(jìn)行濃度檢測(cè),RNA濃度測(cè)定:采用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),按說明書配制反應(yīng)體系及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Q-PCR檢測(cè)目的基因表達(dá):PCR反應(yīng)體系(20 μl體系):cDNA 1 μL,PCR MIX(2x)10 μL,上下游引物各0.4 μL,加DEPC水至20 μL,反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃,30 s,變性95 ℃,3 s,退火30 s,60 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì):使用NCBI或文獻(xiàn)查找目的基因全序列,采用Premier5.0設(shè)計(jì)引物,目的基因引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,相關(guān)信息如下:

    表1 MMP2、LN、FN、collagenIV和β-actin基因的特異性引物序列

    1.2.3.6 Western Blot檢測(cè)FN、LN、Collagen IV、MMP-2蛋白表達(dá) 調(diào)整BPH-1細(xì)胞密度按照2.5×l05個(gè)/mL密度接種于體積中為25 cm3中,置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,分別加入不同濃度的QC(0 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL)以及MMP-2和QC共同作用24 h后。離心去除上清液,使用PBS漂洗、RIPA裂解液抽提蛋白,細(xì)胞蛋白樣品定量,變性;電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂、封閉,洗膜,加入FN、LN、Collagen IV、MMP-2(稀釋倍數(shù)1∶1 000)的一抗以及β-actin(稀釋倍數(shù)1∶1 000)作為陽性對(duì)照,4 ℃震蕩過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋倍數(shù)1∶5 000)后,室溫孵育1 h,TBS洗膜,加入1∶1的ECL發(fā)光液,在25 ℃溫育5 min,即刻曝光,凝膠成像系統(tǒng)掃描并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 QC對(duì)BPH大鼠血清LN、FN、collagenIV、MMP2的影響 模型組血清MMP2含量與空白組比較明顯降低,LN、FN、collagenIV高于空白組(P<0.05);前列寧膠囊各劑量組中MMP2明顯升高(P<0.05);LN、FN、collagenIV各自中均不同程度下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    2.2 QC對(duì)BPH-1細(xì)胞形態(tài)及活性影響 倒置顯微鏡下觀察,各組BPH-1細(xì)胞呈菱,QC干預(yù)后,隨著QC濃度的增加,可觀察到細(xì)胞形態(tài)完整性逐漸改變,形細(xì)胞均勻度,核仁清晰度下降,細(xì)胞數(shù)逐漸減少,加入MMP-2組中較及未加入MMP-2組更為明顯。見圖1。MTT檢測(cè)顯示QC作用24 h及48 h后未加入MMP-2各組細(xì)胞有不同程度活力下降,以5 mg/mL最為明顯。見圖2A。MTT還顯示,QC作用同時(shí)加入MMP-2,各劑量組BPH-1各劑量組細(xì)胞活力24 h時(shí)活力下降,48 h后下降更明顯(P<0.05或P<0.01)并且與QC成量效關(guān)系。見圖2B。

    2.3 QC作用BPH-1細(xì)胞同時(shí)加入MMP-2后對(duì)FN、LN、CollageIV基因及蛋白表達(dá)影響 QC干預(yù)后,隨著QC濃度的增加細(xì)胞中FN、LN、CollageIV基因及蛋白表達(dá)明顯降低見圖3A、B;QC干預(yù)干預(yù)同時(shí)加入MMP-2因子,FN、LN、CollageIV基因及蛋白表達(dá)也明顯降低并且同未加入MMP-2比較更加明顯降低見圖3C、D。

    表2 QC對(duì)BPH大鼠血清中MMP2、LN、FN、collagenIV的影響

    注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05

    圖1 QC作用后及QC作用同時(shí)加入MMP-2后BPH-1細(xì)胞形態(tài)改變(100×)

    圖2 QC作用后及QC作用同時(shí)加入MMP-2后BPH-1細(xì)胞活力變化

    圖3 QC作用后及QC作用同時(shí)加入MMP-2后BPH-1 FN、LN、CollageIV基因及蛋白表達(dá)變化

    圖4 QC作用后對(duì)BPH-1細(xì)胞中MMP-2基因及蛋白表達(dá)影響

    2.4 QC對(duì)BPH-1細(xì)胞中MMP-2基因及蛋白表達(dá)影響 QC干預(yù)后,隨著QC濃度的增加細(xì)胞中MMP-2基因及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),呈現(xiàn)量效關(guān)系見圖4A、B。

    3 討論

    中醫(yī)學(xué)中將良性前列腺增生(BPH)歸屬為“癃閉”“精癃”等范疇,其中醫(yī)病機(jī)及病理、病因目前仍未有合理解釋,研究表明細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)學(xué)說一直是BPH發(fā)病的重要機(jī)制之一,由于ECM給細(xì)胞的生存及活動(dòng)提供適宜的環(huán)境,它可以通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響細(xì)胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化,在維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用[10],ECM也參與調(diào)節(jié)控制細(xì)胞的多種生理和病理過程[11-12],ECM在BPH發(fā)病過程中發(fā)揮的作用是多方面的,例如,前列腺中增殖的細(xì)胞與ECM共同作用導(dǎo)致前列腺組織形態(tài)及生理功能改變[13-14];ECM還可以與雄-雌激素及各種生長因子相互作用導(dǎo)致BPH,可以調(diào)節(jié)前列腺組織中活性肽類物質(zhì)[15],刺激細(xì)胞產(chǎn)生不同的細(xì)胞外基質(zhì)成分[16],加強(qiáng)前列腺細(xì)胞對(duì)雄激素(DHT)及部分生長因子的敏感性,從而改變成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及增強(qiáng)前列腺細(xì)胞對(duì)性激素的敏感性加強(qiáng)基因表達(dá)[17];各種生長因子如TGF-β,這些生長因子從前列腺細(xì)胞中分泌也可以受ECM影響。但是ECM受多種酶類降解,MMPS被認(rèn)為是最重要的一類。MMP-2屬于MMPS家族中的明膠酶,其分布最為廣泛,可降解Ⅳ型膠原、FN和層黏蛋白(LN)等,MMP-2含量的高低對(duì)降解ECM成分發(fā)揮重要作用[18]。

    前列寧膠囊是本課題組以中醫(yī)理論為指導(dǎo)現(xiàn)已開發(fā)為現(xiàn)福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院院內(nèi)制劑(20090521),課題組前期研究發(fā)現(xiàn)前列寧膠囊(QC)具有抑制BPH細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子作用,對(duì)BPH具有良好治療作用[19-22],同時(shí)能夠調(diào)節(jié)部分ECM成分作用;在本實(shí)驗(yàn)中,課題組查閱文獻(xiàn)采用曾多次已成功復(fù)制BPH模型方法制備BPH動(dòng)物模型[9,19,22],實(shí)驗(yàn)表明模型組大鼠血清中FN、LN、Collagen IV含量明顯高于空白組,MMP-2含量明顯低于空白組,表明模型組與空表組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;QC觀察組中,大鼠血清FN、LN、Collagen IV含量較模型組低,而MMP-2含量明顯高于模型組(P<0.05),表明QC能有效降低BPH血清FN、LN、Collagen IV表達(dá)升高M(jìn)MP-2表達(dá)。離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,QC干預(yù)BPH-1細(xì)胞培養(yǎng),并且加入MMP-2因子,實(shí)驗(yàn)表明QC干預(yù)后細(xì)胞活性在低、中、高劑量組中細(xì)胞活性不同程度下降,加入MMP-2后細(xì)胞活性下降更明顯;Q-PCR及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單純用QC干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng),FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表達(dá)明顯降低,MMP-2基因及蛋白表達(dá)升高;QC干預(yù)同時(shí)加入MMP-2后FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表達(dá)較單純QC干預(yù)降低更加明顯,表明在細(xì)胞培養(yǎng)中QC能夠有效抑制FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表達(dá)并且具有增強(qiáng)MMP-2基因及蛋白表達(dá)作用,同時(shí)也表明MMP-2可以抑制FN、LN、Collagen IV基因及蛋白表達(dá)作用。

    綜上所述,QC對(duì)BHP具有明顯治療作用,其治療機(jī)制可能是多靶點(diǎn),前期研究發(fā)現(xiàn)QC具有抑制前列腺細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,對(duì)不同細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)等作用[10-14],本研究還表明,QC具有降低動(dòng)物血清中細(xì)胞外基質(zhì)成分FN、LN、Collagen IV含量作用,抑制BPH-1細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)成分FN、LN、Collagen IV表達(dá),調(diào)控MMP-2的作用,表明QC通過介導(dǎo)MMP-2因子調(diào)控ECM成分的表達(dá)抑制前列腺細(xì)胞增殖是QC治療BPH的另一重要機(jī)制。

    總之,本文證實(shí)了QC通過調(diào)控ECM對(duì)BPH治療作用,區(qū)別于前期報(bào)道QC調(diào)控細(xì)胞凋亡及激素水平治療BPH,為首次報(bào)道,具有一定意義,QC是否能調(diào)控調(diào)控miRNA達(dá)到降解ECM治療BPH;在后期研究中可以從相關(guān)微小基因?yàn)榍腥朦c(diǎn),研究前列寧膠囊對(duì)BPH治療作用,進(jìn)一步闡明前列寧治療機(jī)制。

    猜你喜歡
    貨號(hào)胞外基質(zhì)列寧
    脫細(xì)胞外基質(zhì)制備與應(yīng)用的研究現(xiàn)狀
    鞋品牌新品爆單“故事匯”
    關(guān)于經(jīng)絡(luò)是一種細(xì)胞外基質(zhì)通道的假說
    作者更正致歉說明
    列寧晚年意識(shí)形態(tài)思想及其當(dāng)代啟示
    水螅細(xì)胞外基質(zhì)及其在發(fā)生和再生中的作用
    鐮形棘豆總黃酮對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分的影響
    民意調(diào)查:列寧和斯大林及其在歷史上的地位
    列寧的贈(zèng)言
    紀(jì)念列寧
    不卡视频在线观看欧美| 久久久久久伊人网av| 国产熟女午夜一区二区三区 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲av日韩在线播放| .国产精品久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 中国美白少妇内射xxxbb| 香蕉精品网在线| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲av在线观看美女高潮| 最近的中文字幕免费完整| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 在线观看www视频免费| 最近的中文字幕免费完整| 麻豆乱淫一区二区| 黄色视频在线播放观看不卡| 免费黄色在线免费观看| 另类精品久久| 丝瓜视频免费看黄片| 日本欧美视频一区| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品人妻久久久久久| 国产又色又爽无遮挡免| 九草在线视频观看| av有码第一页| 九九在线视频观看精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品三级大全| 国产亚洲欧美精品永久| 久久影院123| 美女福利国产在线| 国产亚洲精品久久久com| 水蜜桃什么品种好| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 免费少妇av软件| 亚洲在久久综合| 黄色配什么色好看| 国产免费福利视频在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 中文欧美无线码| 极品人妻少妇av视频| 久久久国产一区二区| 久久综合国产亚洲精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 在线观看免费高清a一片| 久久97久久精品| 日本欧美国产在线视频| 熟女人妻精品中文字幕| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲成人一二三区av| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品亚洲成a人片在线观看| 日韩视频在线欧美| 在线观看免费视频网站a站| 赤兔流量卡办理| 国产成人一区二区在线| av有码第一页| 亚洲电影在线观看av| 高清黄色对白视频在线免费看 | 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 男人舔奶头视频| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日本av免费视频播放| 桃花免费在线播放| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 国产女主播在线喷水免费视频网站| 在线观看av片永久免费下载| 国产黄色免费在线视频| av在线观看视频网站免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产男人的电影天堂91| 97在线视频观看| 激情五月婷婷亚洲| 国产视频首页在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 免费av中文字幕在线| 午夜免费鲁丝| 一区二区三区乱码不卡18| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产精品久久久久久久电影| 精品一区二区三卡| 精品酒店卫生间| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美精品一区二区大全| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲综合色惰| 色哟哟·www| 免费观看性生交大片5| 亚洲av免费高清在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 丝袜在线中文字幕| 国产色爽女视频免费观看| 久久av网站| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 黄片无遮挡物在线观看| av免费在线看不卡| 青青草视频在线视频观看| av女优亚洲男人天堂| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 精品酒店卫生间| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | √禁漫天堂资源中文www| 国产黄片视频在线免费观看| 女性被躁到高潮视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 高清午夜精品一区二区三区| 七月丁香在线播放| 2021少妇久久久久久久久久久| av线在线观看网站| 欧美区成人在线视频| 少妇人妻久久综合中文| 一区二区三区免费毛片| 国产日韩欧美亚洲二区| av.在线天堂| 99久久精品热视频| 综合色丁香网| 狂野欧美激情性bbbbbb| 青春草视频在线免费观看| 国产av码专区亚洲av| 七月丁香在线播放| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 日韩 亚洲 欧美在线| 一级爰片在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 男女边吃奶边做爰视频| av女优亚洲男人天堂| 国产免费又黄又爽又色| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲欧洲日产国产| 国产爽快片一区二区三区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美性感艳星| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久99蜜桃精品久久| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲第一av免费看| 精华霜和精华液先用哪个| 一区二区三区乱码不卡18| av专区在线播放| 中文欧美无线码| 国产免费一区二区三区四区乱码| 人人妻人人看人人澡| 亚洲天堂av无毛| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 免费人成在线观看视频色| 街头女战士在线观看网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产一区有黄有色的免费视频| freevideosex欧美| 插阴视频在线观看视频| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产乱人偷精品视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 91精品国产国语对白视频| tube8黄色片| 一级,二级,三级黄色视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产综合精华液| 中文在线观看免费www的网站| 22中文网久久字幕| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲怡红院男人天堂| 国产片特级美女逼逼视频| 国产成人一区二区在线| 一边亲一边摸免费视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 天天操日日干夜夜撸| 青青草视频在线视频观看| 在线观看人妻少妇| av福利片在线| 午夜激情福利司机影院| 插逼视频在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 蜜桃在线观看..| 亚洲伊人久久精品综合| a级毛色黄片| 成人亚洲欧美一区二区av| 午夜久久久在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 日韩av不卡免费在线播放| 国产成人免费无遮挡视频| 免费人成在线观看视频色| 五月伊人婷婷丁香| 精品一区二区三区视频在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲图色成人| 最新的欧美精品一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久狼人影院| 女人精品久久久久毛片| 欧美成人精品欧美一级黄| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品视频人人做人人爽| 美女国产视频在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩av在线免费看完整版不卡| 午夜福利视频精品| 亚洲无线观看免费| 一级片'在线观看视频| 极品教师在线视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 好男人视频免费观看在线| 久久狼人影院| 亚洲伊人久久精品综合| 免费看av在线观看网站| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲色图综合在线观看| 97超碰精品成人国产| 十分钟在线观看高清视频www | 久久人妻熟女aⅴ| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美一级a爱片免费观看看| 观看av在线不卡| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲欧美日韩东京热| 国产亚洲91精品色在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 午夜91福利影院| 亚洲国产精品999| 成人国产av品久久久| 亚洲国产精品国产精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 能在线免费看毛片的网站| 中文资源天堂在线| 有码 亚洲区| 欧美成人午夜免费资源| 五月伊人婷婷丁香| 色视频www国产| 亚洲欧美精品自产自拍| 午夜老司机福利剧场| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 色哟哟·www| 国产乱人偷精品视频| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 永久网站在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 免费看不卡的av| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 高清在线视频一区二区三区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 少妇熟女欧美另类| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 热re99久久国产66热| 人人妻人人看人人澡| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 成人二区视频| 国产精品成人在线| 人妻系列 视频| 免费观看在线日韩| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 9色porny在线观看| 赤兔流量卡办理| 爱豆传媒免费全集在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 日本与韩国留学比较| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 久久韩国三级中文字幕| 岛国毛片在线播放| 我要看日韩黄色一级片| a级一级毛片免费在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 内地一区二区视频在线| 69精品国产乱码久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 人体艺术视频欧美日本| 午夜91福利影院| 亚洲国产日韩一区二区| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久亚洲国产成人精品v| 国产亚洲91精品色在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 午夜av观看不卡| 亚洲国产色片| 九九在线视频观看精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 青青草视频在线视频观看| 国产av一区二区精品久久| 各种免费的搞黄视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产成人aa在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 中文字幕av电影在线播放| 久久av网站| 男女国产视频网站| 国产午夜精品一二区理论片| 男女边吃奶边做爰视频| 人妻 亚洲 视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲人成网站在线播| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲综合精品二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久鲁丝午夜福利片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 男女无遮挡免费网站观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 免费黄网站久久成人精品| 久久国产乱子免费精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品成人在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美精品一区二区免费开放| 国产69精品久久久久777片| 婷婷色麻豆天堂久久| a 毛片基地| 亚洲电影在线观看av| av国产久精品久网站免费入址| 大香蕉久久网| 91精品国产国语对白视频| 免费看光身美女| 9色porny在线观看| 欧美+日韩+精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品色激情综合| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成人国产av品久久久| 久久鲁丝午夜福利片| 人人澡人人妻人| 日韩在线高清观看一区二区三区| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲,欧美,日韩| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 赤兔流量卡办理| 97在线视频观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 日韩电影二区| 久久久精品94久久精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 看十八女毛片水多多多| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 九草在线视频观看| av卡一久久| 国产黄片美女视频| 精品少妇内射三级| 久久国产精品大桥未久av | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 最近的中文字幕免费完整| 在线观看av片永久免费下载| 99热全是精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 26uuu在线亚洲综合色| 国产精品久久久久久久久免| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 亚洲欧美精品专区久久| 香蕉精品网在线| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美 日韩 精品 国产| 国产 一区精品| 香蕉精品网在线| 国产一区二区在线观看日韩| 丝瓜视频免费看黄片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久久久久久久久久丰满| 国产成人91sexporn| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 91成人精品电影| 日本vs欧美在线观看视频 | a级毛片免费高清观看在线播放| av视频免费观看在线观看| 男女国产视频网站| 在线精品无人区一区二区三| 黄色怎么调成土黄色| 免费大片黄手机在线观看| 日日爽夜夜爽网站| av天堂中文字幕网| 大香蕉97超碰在线| 欧美精品一区二区大全| 国产精品国产三级国产专区5o| 只有这里有精品99| 中文字幕制服av| 人人妻人人澡人人看| 丝瓜视频免费看黄片| 美女国产视频在线观看| 日韩视频在线欧美| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 人妻一区二区av| 免费观看性生交大片5| 五月开心婷婷网| 嫩草影院入口| 日本黄大片高清| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产黄色免费在线视频| 日韩一区二区三区影片| 日韩中字成人| 乱人伦中国视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产高清国产精品国产三级| 伊人久久精品亚洲午夜| 好男人视频免费观看在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国内精品宾馆在线| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品一二三区在线看| 国产精品无大码| 国产91av在线免费观看| 97超视频在线观看视频| 日韩视频在线欧美| 成人漫画全彩无遮挡| 国产在线视频一区二区| 最后的刺客免费高清国语| av.在线天堂| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩欧美一区视频在线观看 | 午夜福利,免费看| 国产高清有码在线观看视频| 熟女电影av网| 欧美xxxx性猛交bbbb| 只有这里有精品99| 自线自在国产av| 中国三级夫妇交换| 秋霞伦理黄片| 久久青草综合色| 成人亚洲精品一区在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲怡红院男人天堂| 国产成人精品一,二区| 97在线视频观看| 亚洲久久久国产精品| 嫩草影院入口| 边亲边吃奶的免费视频| 成人二区视频| 一级毛片 在线播放| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产精品女同一区二区软件| 女人久久www免费人成看片| 最近手机中文字幕大全| 亚洲av中文av极速乱| 香蕉精品网在线| 亚洲av.av天堂| 秋霞伦理黄片| av国产精品久久久久影院| 99精国产麻豆久久婷婷| 最近2019中文字幕mv第一页| 69精品国产乱码久久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 丰满乱子伦码专区| 国产成人freesex在线| 精品久久久精品久久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 一级av片app| 亚洲av男天堂| 3wmmmm亚洲av在线观看| 99热这里只有是精品50| 中国国产av一级| 亚洲av二区三区四区| 五月天丁香电影| 中文欧美无线码| 高清在线视频一区二区三区| 一级毛片电影观看| 亚洲中文av在线| 99久国产av精品国产电影| 亚洲av中文av极速乱| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产成人a∨麻豆精品| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美丝袜亚洲另类| 色吧在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 热re99久久国产66热| 边亲边吃奶的免费视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 各种免费的搞黄视频| 久久亚洲国产成人精品v| 大片免费播放器 马上看| 交换朋友夫妻互换小说| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩大片免费观看网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 精品久久久精品久久久| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美成人午夜免费资源| 国产精品欧美亚洲77777| 国产成人精品福利久久| 曰老女人黄片| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 99re6热这里在线精品视频| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲精品自拍成人| 高清毛片免费看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 五月开心婷婷网| 曰老女人黄片| 99热国产这里只有精品6| 精品视频人人做人人爽| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品一区二区性色av| 亚洲精品456在线播放app| 黑人高潮一二区| 国产成人一区二区在线| 免费观看的影片在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 十八禁高潮呻吟视频 | h日本视频在线播放| 国产精品一区www在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 男女无遮挡免费网站观看| 国产av国产精品国产| 午夜福利网站1000一区二区三区| 中文字幕制服av| 少妇的逼好多水| 大香蕉久久网| 国产美女午夜福利| 国产一区二区在线观看av| 人人妻人人看人人澡| 精品国产国语对白av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| videos熟女内射| 青春草亚洲视频在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 青春草国产在线视频| 亚洲av.av天堂| 亚洲无线观看免费| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产免费又黄又爽又色| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 交换朋友夫妻互换小说| 高清毛片免费看| 久久ye,这里只有精品| 精品国产露脸久久av麻豆| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美精品国产亚洲| 少妇高潮的动态图| 免费黄色在线免费观看| 桃花免费在线播放| 麻豆成人av视频| 女性被躁到高潮视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 精品一品国产午夜福利视频| 精品少妇内射三级| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产色爽女视频免费观看| 日本av手机在线免费观看| 天天操日日干夜夜撸| 九九爱精品视频在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品伦人一区二区| 2018国产大陆天天弄谢| .国产精品久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲av福利一区| 国产在线免费精品| 亚洲精品成人av观看孕妇| 色吧在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产在视频线精品| 国产一区二区三区av在线| 国产淫语在线视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 中文欧美无线码| 免费人成在线观看视频色| 美女内射精品一级片tv| 免费人妻精品一区二区三区视频| 精品久久久噜噜| 毛片一级片免费看久久久久| 午夜日本视频在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲国产av新网站| 色5月婷婷丁香| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产毛片在线视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲综合色惰| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 久久久国产一区二区| av福利片在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 97在线视频观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 内地一区二区视频在线| 青青草视频在线视频观看|