基于高效液相指紋圖譜檢測參苓白術散中人參皂苷的含量測定

王雪梅 李艷嬌 宋燕青

(吉林大學第一醫(yī)院藥學部,長春,130000)

參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》,是以四君子湯為基礎的,處方由人參、茯苓、白術、山藥、甘草、白扁豆、蓮子等十味藥組成,所有藥物均以全原粉入藥,主要起補脾胃、益肺氣的功用[1-3]。目前2015年版《中華人民共和國藥典》(一部)中有收載參苓白術散這一以人參為君藥的藥方,但目前參苓白術散質量標準尚未收載人參或人參皂苷含量測定項[4],而市面上參苓白術散的廠家較多,且原藥材人參的質量差異也很大。因此人參皂苷作為人參中的重要成分,通過測定參苓白術散中人參皂苷的含量,可以作為控制參苓白術散質量的一個重要指標。目前常用的人參皂苷含量測定方法有可見-紫外分光光度法[5-6]、薄層掃描法(TLCS)[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8],其中HPLC的具有高效性、高靈敏度、較廣的應用范圍而為越來越多中藥研究人員使用和認可,因此本研究以不同廠家不同批次的15批參苓白術散進行檢測,建立參苓白術散中3種人參皂苷Rg1、Re及Rb1含量測定的方法?，F(xiàn)具體報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilengt-1100高效液相色譜儀(Agilengt公司購買),ThermoODS-HYPERSIL色譜柱(廣州太瑋生物科技有限公司購買),FR10小型超聲波清洗器(功率250 W,頻率50 Hz;杭州法蘭特超聲波科技有限公司)。

1.2 試劑 中國食品藥品檢定研究院人參皂苷Rg1對照品(批號:110703-201027)、人參皂苷Re對照品(批號:110754-200822)和人參皂苷Rb1對照品(批號:110704-20092),色譜純和分析純均購買于天津賽孚瑞科技有限公司。

1.3 分析樣品 參苓白術散(哈藥集團世一堂制藥廠,國藥準字Z23022087),分別取15個不同批次,依次編號為001、002、003、004、005……015。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 進樣量為10 μL,采用250 mm×4.6 mm,5 μm的色譜柱(ThermoODS-HYPERSIL柱),選擇流動相的條件是在A流動相乙腈和B流動相水中以1 mL/min的流速開展實驗,檢測波長為203 nm,柱溫為30 ℃,根據(jù)高效液相(HPLC)(Agilengt-1100高效液相色譜儀)指紋圖譜的梯度洗脫程序進行試驗,并在Agilengt-1100色譜工作站上進行指紋圖譜分析。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取購于中國食品藥品檢定研究院人參皂苷Rg1對照品(批號:110703-201027)、人參皂苷Re對照品(批號:110754-200822)和人參皂苷Rb1對照品(批號:110704-20092)置于容量瓶中,甲醇溶解,制成混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取5個不同生產(chǎn)批次分別編號為001、002、003……015的參苓白術散的內(nèi)容物,精密取5 g粉末,采用四號篩過濾于濾紙筒中,整筒藥品經(jīng)過含有三氯甲烷提取器加熱回流3 h,棄去廢液,含有藥渣濾紙筒移入100 mL錐形瓶中,精密加入50 mL水飽和正丁醇,密塞放置12 h以上,后采用FR10小型超聲波清洗器(功率250 W,頻率50 Hz;杭州法蘭特超聲波科技有限公司)進行超聲處理30 min,濾過,棄初濾液僅取續(xù)濾液25 mL,蒸干取殘渣并加甲醇溶解、定容并搖勻,用0.45 μm濾膜濾過即得供試品溶液。陰性樣品溶液則取不含人參的參苓白術散同上述方法進行制備。

2.4 專屬性試驗 分別取對照品溶液和供試品溶液進行HPLC檢測,記錄色譜圖并對專屬性進行比較,結果顯示人參皂苷Rg1、Re及Rb1均有良好的專屬性。

2.5 線性關系考察 根據(jù)2.2制備的人參皂苷對照品溶液,分別精密取加入甲醇制備0 μL、1 μL、2 μL、5 μL、10 μL等,分別編號1～4并連續(xù)進樣,以峰面積為Y軸,5 μL進樣濃度為X軸,繪制標準曲線,并根據(jù)人參皂苷對照品的回歸方程計算各有效成分在各自濃度范圍內(nèi)的線性關系。提示人參皂苷的線性關系良好。見表1。

表1 人參皂苷的回歸方程

2.6 中間精密度試驗 精密吸取上述人混合參皂苷對照品溶液10 μL,連續(xù)進樣6次,在上述2.1色譜條件下,記錄峰面積,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD在0.22%～0.29%,結果表明HPLC儀器精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 取同一參苓白術散供試品溶液,在上述2.1色譜條件下,分別于0、4、11、20、30 h等不同的時間點進行進樣測定,結果顯示人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD在0.06%～1.83%；表明參苓白術散供試品溶液在30 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 精密取6份參苓白術散供試品溶液,按上述2.1色譜條件進行測定,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1總量的含量平均值為9.86 mg,RSD2.5%,表明參苓白術散供試品溶液的重復性良好。

2.9 回收率試驗 精密稱定,置具塞錐形瓶中,一式6份,以3份為一組,分別精密加入混合對照品溶液0.4、0.5、0.6 mL,精密加入70%甲醇溶液20 mL,稱定質量,超聲處理30 min,放冷,再稱定質量,分別用70%甲醇溶液補足減失的質量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,進樣分析,記錄峰面積,測定加樣回收率,如表2～4結果顯示人參皂苷的加樣回收率良好。

表2 人參皂苷Rg1加樣回收率

表3 人參皂苷Re加樣回收率

表4 人參皂苷Rb1加樣回收率

2.10 樣品測定結果

2.10.1 參苓白術散HPLC指紋圖譜分析 根據(jù)國家藥典委員會提出的中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A進行相似度分析,采用MATLAB軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計。由圖1、圖2得,通過HPLC指紋圖譜分析,人參皂苷混合對照品分別于參苓白術散供試品溶液的色譜峰保留時間一致,且陰性對照溶液未對其造成干擾影響。

圖1 參苓白術散高效液相指紋圖譜

注：A.人參皂苷混合對照品溶液,B.參苓白術散供試品溶液,C陰性供試品溶液

2.10.2 人參皂苷含量測定 不同批次參苓白術散中人參皂苷總的含量存在較大差別。見表5。

表5 參苓白術散中人參皂苷的含量測定

3 討論

3.1 流動相的選擇 在參苓白術散定量檢測工作中,人參的是參苓白術散中的君藥,其主要檢測成分是人參皂苷,目前檢測人參皂苷的鑒別或定量分析方法都比較成熟[9-11],而人參皂苷中常用檢測的是Rg1、Re、Rb1等3種亞型，其中可見-紫外分光分光度法只能檢測總皂苷而對亞型的敏感性較低故予以排除,而在薄層掃描法(TLCS)操作環(huán)節(jié)繁瑣,且由于TLCS相對較容易受外界條件影響;其中HPLC因其操作過程較為簡便,且整個分離過程系統(tǒng)較為封閉,突出HPLC的高效性、高靈敏度和較廣的應用范圍,因此選用HPLC指紋圖譜作為本研究的主要方法[12-14]。本研究流動相的選擇中Rg1和Rb1檢測方法,在C18柱中,試驗探索性研究曾比較甲醇-水和乙腈-水作為流動相的差異,Re和Rg1在流動相60%甲醇或者15%乙腈均能夠洗脫,且分離度較好;而Rb1的流動相在80%甲醇或者40%乙腈的情況下也能夠洗脫出比例超過1∶1分離度,但從總的結果分析中發(fā)現(xiàn),當流動相是乙腈-水的時候,Rg1無論從峰形的分離度、干擾度和總共所用的分析時間來說結果最好,能夠分離出最低基線噪聲且峰形最好。

3.2 HPLC嚴謹性考察意義 線性回歸方程在某一個濃度或峰高(面積)情況下進行樣品分析是否是準確的,換句話說,在這個成線性范圍內(nèi),待測參苓白術散樣品溶液面積要與濃度成正比,因為在這個范圍內(nèi)濃度與面積成正比,分析結果才是準確的且符合紫外檢測器的朗伯比爾定律[12-14]。而加樣回收率試驗的研究一般包括絕對回收率試驗和相對回收率試驗,本研究參苓白術散所涉及的是相對回收率試驗;有研究人員表示相對回收率主要一種是回收試驗法,而另外一種是加樣回收試驗法[17-18]。因為加樣回收試驗法,就是在已知濃度樣品中加入藥物,來和標準曲線比,標準曲線也是在基質中加藥物,因此本研究HPLC的嚴謹性的考察選用加樣回收試驗法。

3.3 檢測波長的確定 經(jīng)二極管陣列檢測器進行紫外光譜掃描,發(fā)現(xiàn)在不同波長的檢測下,參苓白術散樣品色譜圖在203 nm處有最大吸收,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1色譜峰的紫外光譜掃描結果與對照品一致,故本研究確定檢測波長為203 nm。

3.4 含量測定提取方法的選擇 經(jīng)查閱大量文獻[11,19-22]已選擇高效液相色譜法對參苓白術散人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量進行測定,目前的研究對參苓白術丸中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量報道仍較少。本研究試圖通過對人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的HPLC指紋圖譜分析以及對總的人參皂苷的總含量測定對參苓白術散的質量做一個分析研究。在HPLC指紋圖譜試驗中采取回流提取、超聲提取等多種方法,結果顯示超聲處理提取效率最高,故本研究采用超聲處理的提取方式對參苓白術散中的人參皂苷進行提取。同時在提取溶劑的選擇中,對50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇等4種不同濃度的提取溶劑進行了考察,結果發(fā)現(xiàn)乙醇的提取效率最低,而甲醇提取溶劑僅當其濃度為70%進行提取時,研究可獲得最高人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的提取效率,故本研究選擇用70%甲醇作為提取溶劑。