重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白對衰老模型小鼠的抗衰老作用

劉 凱 劉媛媛 孫 非 任立群

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

1 吉林大學(xué)藥學(xué)院

重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)是通過基因工程方法，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建酵母表達(dá)載體P819-LZ-8，然后轉(zhuǎn)化到畢赤菌株GS115中表達(dá)，最終經(jīng)發(fā)酵和純化所得，其與天然LZ-8具有相同生物活性〔1，2〕。研究顯示〔3～5〕，rLZ-8具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松及免疫調(diào)節(jié)作用，但有關(guān)rLZ-8抗衰老作用尚無報(bào)道。鑒于LZ-8抗衰老作用明顯〔6〕，本研究對rLZ-8抗小鼠衰老作用進(jìn)行研究，以期為rLZ-8的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 昆明種小鼠，60只，雌雄各半，體重(20±2)g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2試劑與儀器 D-半乳糖購自美國Sigma公司；rLZ-8由吉林大學(xué)鉆智基因工程藥物研究中心提供；DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀(華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、褪黑素(MT)試劑盒均購自南京建成生物試劑有限公司。

1.3衰老小鼠模型的制備及分組 隨機(jī)分為5組，即空白對照組、模型組、rLZ-8低、中、高(660、990、1 320 μg/kg)劑量組，每組各12只。各組適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，除空白對照組外，其余各組分別皮下注射D-半乳糖(1 g·kg-1·d-1)，連續(xù)注射42 d，造模期間，空白對照組皮下注射等體積生理鹽水。成模后，將各組背部(脊柱兩側(cè)，肩胛下)區(qū)域剃毛(面積均為2 cm×2 cm)，rLZ-8各劑量組分別涂抹給藥，連續(xù)涂抹60 d，空白對照組與模型組用純基質(zhì)涂抹。給藥期間小鼠自由進(jìn)食和飲水。

1.4組織樣品的制備 末次給藥1 h后，摘眼球取血，常規(guī)分離血清，-80℃凍存?zhèn)溆?。動物處死后，取給藥部位皮膚，去除皮下脂肪，一部分多聚甲醛固定，另一部分-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1rLZ-8對各組血清SOD、CAT、GSH-Px、MT和MDA水平的影響 與空白對照組相比，衰老模型組SOD、CAT、GSH-Px及MT水平均顯著降低(P<0.05)，MDA水平顯著升高(P<0.05)；與衰老模型組相比，rLZ-8高劑量組可顯著提升血清中SOD、CAT、GSH-Px及MT水平，顯著降低MDA水平，中劑量組可顯著增加SOD、MT水平，呈劑量依賴性，見表1。

2.2rLZ-8對各組皮膚勻漿中SOD、CAT、GSH-Px和MDA水平的影響 與空白對照組相比，衰老模型組SOD、CAT及GSH-Px水平均顯著降低，MDA水平顯著升高；與衰老模型組相比，rLZ-8高劑量組可顯著提升皮膚中SOD、CAT、GSH-Px及MT水平，同時(shí)降低MDA水平，中劑量可顯著增加GSH-Px水平，顯著降低MDA水平，且呈劑量依賴性，見表2。

表1 各組血清中SOD、CAT、GSH-Px、MT和MDA水平

與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與衰老模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

表2 各組皮膚中SOD、CAT、GSH-Px和MDA水平

3 討 論

皮下注射D-半乳糖構(gòu)建衰老模型是研究藥物抗衰老的經(jīng)典模型，D-半乳糖在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)一系列代謝反應(yīng)最終破壞機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)，造成脂質(zhì)過氧化，脂褐質(zhì)堆積從而造成與老齡小鼠相似的衰老癥狀〔7〕。機(jī)體的抗氧化能力與SOD、CAT、GSH-Px和MDA等指標(biāo)水平密切相關(guān)，其中，SOD被稱為機(jī)體內(nèi)的清道夫，是衡量機(jī)體抗氧化能力的最重要物質(zhì)之一；CAT是過氧化物酶體的標(biāo)志酶，其主要作用是將對機(jī)體有害的過氧化氫轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)；GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種過氧化物分解酶，其主要作用是保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能；而MDA是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物，是衡量機(jī)體衰老的重要指標(biāo)。MT是哺乳動物松果體產(chǎn)生的一種胺類激素，除具有抗擊腫瘤、改善睡眠、調(diào)節(jié)免疫功能外，醫(yī)學(xué)上常把它作為機(jī)體延緩衰老的重要指標(biāo)之一。

本研究結(jié)果提示，rLZ-8的抗衰老作用與其提高抗氧化物酶活性及其抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生等一系列抗氧化作用密切相關(guān)。rLZ-8可通過上調(diào)機(jī)體內(nèi)延緩衰老物質(zhì)MT水平達(dá)到延緩機(jī)體衰老的作用。