食蟹猴自發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎模型的中藥干預(yù)實驗

陳巧玉 扶世杰

(西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000)

近年來，中醫(yī)藥在膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)的治療中取得較大進展。獨活寄生湯具有祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎、補氣血之功。近年來，該方劑在骨關(guān)節(jié)炎(OA)的治療上逐漸受到關(guān)注。目前還沒有任何藥物可以使OA的病情逆轉(zhuǎn)或停止〔1〕，對于KOA軟骨組織作用的有效靶點和部位也尚不明確，這可能源于OA中存在更多的各種致病因子及其相關(guān)因子、動物模型與人類基因的差異等因素。本文選用與人類基因型和行走方式非常類似的食蟹猴，構(gòu)建自發(fā)性KOA動物模型，以痹證論治KOA理論為依據(jù)，采用獨活寄生湯進行藥物干預(yù)，探討其治療的有效靶點和部位，為進一步藥物治療的療效檢驗及安全性評估提供可靠保證。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級青年型(正常膝關(guān)節(jié)，年齡3～5歲)和老年型食蟹猴(自發(fā)性KOA，年齡≥20歲)各6只，體重4～6 kg，由云南靈長類實驗動物有限公司提供。12只食蟹猴適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w，自然光照，溫度16～26℃；給予充足的食物和潔靜水，允許其自由活動。老年型以生理鹽水熱敷6 w，隨機分為空白對照組和干預(yù)組，每組3只；干預(yù)組以獨活寄生湯熱敷6 w。實驗過程符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。

1.2主要實驗試劑 PV9000試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液、TritonX-100、Tween 20，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1抗體(Santa cruz 1∶100)，氯化鈉(NaCl)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、多聚甲醛、鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)、乙醇、二甲苯、中性樹膠、脫鈣液、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、檸檬酸鹽緩沖液(粉劑，2 000 ml/袋)、封閉用正常羊血清。

1.3主要實驗儀器 超凈工作臺、離心機、隔水式電熱37℃恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、電熱恒溫水浴鍋、快速混勻器、電子天平、顯微鏡等。

1.4實驗藥物 獨活寄生湯由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供，藥物組成：獨活20 g、桑寄生20 g、杜仲20 g、牛膝20 g、秦艽15 g、防風(fēng)12 g、細辛6 g、桂心12 g、茯苓20 g、當(dāng)歸12 g、熟地12 g、川芎12 g、路路通15 g、海桐皮15 g、伸筋草15 g、桃仁12 g、紅花12 g、丁香15 g、甘草6 g。

1.5標(biāo)本采集及效應(yīng)指標(biāo)測定 將各組食蟹猴仰臥捆綁于動物手術(shù)臺上，股動脈取血 3 ml置于5 ml試管中，在37℃溫箱中溫浴0.5～1.0 h后以3 000 r/min離心15 min，然后取血清1 ml置于-20℃冰箱保存。抽取各組食蟹猴右側(cè)膝關(guān)節(jié)沖洗液(無菌蒸餾水沖洗) 1 ml，肉眼觀察關(guān)節(jié)液性狀，包括顏色、透明度和黏稠度，然后以3 000 r/min離心15 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。待所有標(biāo)本采集完畢后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清白細胞(WBC)、紅細胞沉降率、C反應(yīng)蛋白(CRP)、關(guān)節(jié)液腫瘤壞死因子(TNF)-α含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進行。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1青年型和老年型退變膝關(guān)節(jié)比較 青年型關(guān)節(jié)液性狀透明、清亮、黏稠度中；老年型關(guān)節(jié)液顏色較深、清亮、黏稠度更高。老年型關(guān)節(jié)液TNF-α、CRP和紅細胞沉降率顯著高于青年型(P=0.000)，見表1。

2.2空白對照組與干預(yù)組關(guān)節(jié)液性狀變化 與空白對照組(關(guān)節(jié)液黃、清亮、黏稠度高)相比，干預(yù)組干預(yù)2 w無明顯變化；干預(yù)4 w，顏色由黃變?yōu)榈S，黏稠度改變不明顯；干預(yù)6 w，黏稠度稍有降低。

2.3空白對照組與干預(yù)組關(guān)節(jié)液TNF-α、WBC、紅細胞沉降率、CRP含量比較 與空白對照組比較，干預(yù)組干預(yù)2、4、6 w TNF-α含量明顯降低(P=0.000)；WBC、紅細胞沉降率含量變化不明顯(P>0.05);干預(yù)2、4、6 w，干預(yù)組CRP含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

與青年型比較：1)P=0.000

表2 干預(yù)前后各組關(guān)節(jié)液TNF-α、WBC、紅細胞沉降率、CRP含量比較

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，食蟹猴自發(fā)性O(shè)A模型的流行病學(xué)和關(guān)節(jié)病理學(xué)改變與人相似〔2～4〕；其關(guān)節(jié)的大小適中，不但可以滿足對于生物化學(xué)指標(biāo)的采集，也能滿足放射學(xué)和組織學(xué)研究。隨著年齡老化，會出現(xiàn)典型的OA改變〔5〕；與本實驗結(jié)果相符。此外，此類動物有較長的生命跨度，是人類慢性疾病的最佳實驗材料之一〔6〕。選用食蟹猴自發(fā)性KOA 模型能夠避免由于人工誘導(dǎo)的OA，更有效地模擬人類KOA發(fā)生發(fā)展過程，在關(guān)節(jié)軟骨生化改變、OA發(fā)病機制、尤其在療效比較等方面的優(yōu)勢明顯。參照《獸醫(yī)臨床病理學(xué) 》〔6〕，一般情況下，健康動物的關(guān)節(jié)液呈無色至淡黃色，澄清透明，含有黏蛋白，故較為黏稠。臨床上一般通過主觀印象判斷。當(dāng)出現(xiàn)炎癥時，由于細胞數(shù)和纖維蛋白原含量增加，則出現(xiàn)不同程度的混濁，主觀上也可表現(xiàn)為關(guān)節(jié)液顏色變深；而炎癥時透明質(zhì)酸酶下降導(dǎo)致黏蛋白降解，或因關(guān)節(jié)液量增多，黏蛋白被稀釋可導(dǎo)致黏稠度降低。本實驗結(jié)果提示，獨活寄生湯干預(yù)可能減輕因炎癥引起的關(guān)節(jié)液細胞數(shù)量增多而導(dǎo)致的混濁，但對于與透明質(zhì)酸質(zhì)量相關(guān)的關(guān)節(jié)液黏稠度改變不明顯。

研究表明，在KOA患者關(guān)節(jié)滑液中TNF-α水平增加，參與了關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)；不僅在OA患者，正常軟骨細胞采用TNF-α刺激，其基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、3 mRNA和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)-1的表達明顯上調(diào)〔7〕。TNF-α可通過多途徑參與OA，如經(jīng)典的細胞凋亡途徑、MMPs介導(dǎo)的軟骨細胞外基質(zhì)降解，對Ⅱ/Ⅰ型膠原蛋白的誘導(dǎo)分化導(dǎo)致的軟骨基質(zhì)降解。Guo等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子在OA患者的活性，特別是XBP1S片段在TNF-α處理后表達顯著增加。這種聯(lián)系可能為OA提供新的治療途徑。最新細胞模型和動物實驗發(fā)現(xiàn)，OA與糖酵解代謝紊亂之間存在一定關(guān)系〔9，10〕，6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶(PFKFB)3在OA軟骨中調(diào)節(jié)糖酵解作用的表達變化〔11〕，發(fā)現(xiàn)PFKFB3在OA軟骨組織或TNF-α刺激軟骨細胞時的表達下調(diào)。OA炎癥與這些內(nèi)源性途徑之間存在的關(guān)系，可能為OA提供一個潛在的預(yù)防或治療靶點。

在自發(fā)性KOA中，患者關(guān)節(jié)液的WBC常見增高，但外周血WBC改變并不明顯?？赡苁窃从谧园l(fā)性KOA的炎癥絕大多數(shù)屬于無菌性炎癥。除外合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或其他感染性疾病時，可見全血WBC和紅細胞沉降率的異常。本實驗中，獨活寄生湯干預(yù)對模型組的全血WBC和紅細胞沉降率影響并不明顯；從藥物治療的效果來看，隨著時間延長，并未呈現(xiàn)降低趨勢。這也可能與實驗動物模型個體間本身的差異有關(guān)?？傮w說來，全血WBC和紅細胞沉降率對于自發(fā)性O(shè)A的診斷價值有限，但可作為關(guān)節(jié)炎鑒別診斷和療效判斷的指標(biāo)之一。

CRP是在感染和組織損傷時血漿濃度快速、急劇升高的主要急性炎相期蛋白。傳統(tǒng)觀點認為CRP為非特異性的炎癥標(biāo)志物，常作為反映類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效的指標(biāo)。其與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情及骨質(zhì)破壞的發(fā)生和發(fā)展呈正相關(guān)。但在OA診斷中，CRP的檢測意義往往并不具特異性，而常被作為療效判斷的指標(biāo)之一。一份關(guān)于KOA疼痛患者CRP變化的回顧調(diào)查結(jié)果顯示，在1 156例檢測CRP的患者中，CRP異常者占5.5%(64例)，檢測的834例患者中，異常者占23.14%(193例)〔12〕。CRP雖不能作為診斷OA的特異性指標(biāo)，但對于炎癥嚴(yán)重者及OA合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或伴隨其他感染性疾病的鑒別診斷，其檢測具有重要參考價值。

隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床上可以用新的敏感方法檢測出低濃度CRP，稱為高敏CRP (hs-CRP)。目前，hs-CRP 已被證實是由細胞因子尤其是白細胞介素(IL)-6 刺激而產(chǎn)生，與慢性低水平活動的細胞因子相關(guān)，是慢性炎癥引發(fā)心血管疾病的獨立危險因素〔13，14〕。一項對大樣本的中老年人群(包括健康人群、OA早期患者)血漿hs-CRP水平的檢測結(jié)果顯示，OA組明顯高于對照組，與炎癥程度正相關(guān)，說明OA患者在早期有炎癥存在〔15〕。另有對比研究發(fā)現(xiàn)，處于KOA活動期表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛的患者，其血漿hs-CRP水平明顯高于放射學(xué)(無癥狀)的KOA患者，且后者血清hs-CRP水平高于正常對照組〔16〕。hs-CRP在OA早期階段可能具有診斷意義，有望成為OA的常規(guī)檢測手段。但hs-CRP參與OA具體機制尚不清楚。國外有研究認為，hs-CRP 可能誘導(dǎo)了IL-6的分泌，激活巨噬細胞表達細胞因子，也可能放大了其他介質(zhì)的炎癥前作用〔17，18〕。

最新關(guān)于獨活寄生湯治療OA的Meta分析顯示，該方劑可改善KOA患者的臨床癥狀，緩解患者疼痛，其療效優(yōu)于西醫(yī)治療〔19，20〕。但具體的作用機制與途徑還不十分清楚；在臨床長期持續(xù)的療效方面還有待驗證；對于不同人群存在療效差異，也還缺乏較充分的臨床研究數(shù)據(jù)。本研究結(jié)果顯示，獨活寄生湯干預(yù)對食蟹猴自發(fā)性KOA關(guān)節(jié)液TNF-α有直接抑制作用，能夠降低全血WBC及CRP水平。

此外，最新研究發(fā)現(xiàn)的一些與OA疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，如：血清和滑膜中抵抗素〔21〕、Ihh〔22〕、Toll樣受體〔23〕；與軟骨修復(fù)和重塑相關(guān)的干細胞或祖細胞(CSPCs)〔24〕，一些軟骨基質(zhì)蛋白酶，如軟骨蛋白激酶B(Akt)、蛋白激酶(PK)Cα也參與了OA的進展〔25〕。其復(fù)雜的相互作用，獨活寄生湯與其是否有作用及其機制，有待進一步探索。